一测多评法测定不同产地芫花中3种活性成分的含量*

马瑞瑞，吴文平，罗宇琴，邱韵静，李国卫，魏 梅，孙冬梅，陈向东

（广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244）

[关键字]芫花；一测多评法；校正因子；芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷；芹菜素；芫花素；含量测定

芫花为瑞香科植物芫花Daphen genkwa Sieb.et Zucc.的干燥花蕾，春季花未开放时采收，除去杂质，干燥[1]。主要分布于华东及河北、陕西、河南、湖北、湖南、四川、贵州等地。芫花的化学成分主要包括黄酮类、二萜原酸酯类、绿原酸类、木脂素类等，其中黄酮类成分包括芫花素、羟基芫花素、木犀草素、椴树苷、芹菜素、槲皮苷、芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷等，此外还包括二萜原酸酯类如芫花酯甲、芫花酯乙等。芫花性温，味苦、辛，具有泄水逐饮的功能，外用杀虫疗疮[1-4]。临床主要用于水肿胀满、胸腹积水、痰饮积聚、气逆咳喘、二便不利；外治疥廯秃疮，痈肿，冻疮。目前对芫花的含量测定研究多集中于对芫花素的含量测定，而芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸、芹菜素等相关的文献研究较少。中药的整体性主要体现在其有效成分群发挥药理药效作用，因此，采用一测多评法（QAMS）对中药有效成分群进行检测更能反映中药材内在质量。

目前一测多评法在中药质量控制中已广泛应用[5-10]，该方法快速、简便并且能实现同时检测多个成分，是一种符合中药多成分特点的多指标质量评价模式。本实验采用HPLC法同时测定了芫花中芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素、芫花素的含量，并通过选用芫花素为内标物质计算不同成分的校正因子（f）建立一测多评方法，计算各化学成分的含量，为中药材芫花多成分含量的测定与质量控制提供了全新的分析模式。

1 材料与仪器

1.1 材料 芹菜素对照品（批号：111901-201603，含量：99.2%），芫花素对照品（批号：111899-201202，含量：94.9%）及芫花对照药材（批号：121062-201403）均购于中国食品药品检定研究院；芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷（批号：ST0892012MG，含量：99.6%）购于上海诗丹德生物科技有限公司；水为超纯水；甲醇、磷酸为色谱纯，其他试剂为分析纯。本实验所用的芫花药材，经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定为芫花Daphen genkwa Sieb.et Zucc.的干燥花蕾，样品采集信息见表1。

表1 样品信息表

1.2 仪器Waters e2695型高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；Waters HSS T3色谱柱（4.6 mm×250 mm，5.0μm)；Agilent TC C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5.0μm）；KQ-500型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；ME-204E型万分之一天平、XP-26型百万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Milli-Q Direct型超纯水系统（美国默克股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件Waters HSS T3色谱柱（4.6mm×250mm，5.0μm)；以甲醇为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，按梯度洗脱（0～3 min，20%→43%A；3～25 min，43%→45%A；25～35 min，45%→60%A；35～50 min，60%→90%A）；流速为1.0 mL/min；进样量为10μL；柱温为35℃；检测波长为350 nm。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素、芫花素对照品适量，加甲醇制成每1 mL含芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷605.4μg、芹菜素565.6μg、芫花素229.3μg的混合对照品贮备液；取上述贮备液加甲醇制成每1mL含芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷60.54μg、芹菜素56.56μg、芫花素22.93μg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取芫花饮片粉末（过三号筛）约0.2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 系统适用性试验 精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液与“2.3”项下供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件。各色谱峰分离度良好，表明各方法专属性较好。（见图1）

图1 混合对照品及供试品HPLC色谱图

2.4.2 线性关系考察 分别精密取混合对照品贮备液5.0、2.0、1.0、0.5、0.2、0.1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得到不同浓度的对照品溶液，并按照“2.1”项下色谱条件进样分析，以进样浓度x（μg/mL）为横坐标，以峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表2。

表2 3种成分回归方程、相关系数和线性范围

2.4.3 精密度试验 精密吸取“2.3”供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6针，计算芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素及芫花素峰面积的RSD分别为0.26%、0.28%和0.23%，仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、16、24 h进样测定，计算芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素及芫花素峰面积的RSD分别为1.53%、0.90%和0.71%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.5 重复性试验 称取同一芫花样品（过三号筛）约0.2 g，平行6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样测定，测得芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素和芫花素的含量RSD分别为1.35%、0.68%和0.44%，表明方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 取同一已知含量的样品约0.1 g，平行9份，精密称定，置具塞锥形瓶中，按样品含量∶对照品加入量为1∶0.5、1∶1、1∶1.5加入对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件分析，计算加样回收率，结果芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素和芫花素的平均加样回收率分别为94.22%、95.48%和97.56%，其RSD（n=9）分别为1.47%、1.69%和3.18%，表明方法准确度良好，结果见表3。

表3 加样回收率考察结果

2.5 校正因子考察

2.5.1 校正因子计算 分别精密吸取“2.4.2”项下的对照品溶液”，按照“2.1”项下色谱条件”进样，采用多点校正法计算相对校正因子，以芫花素为内标，按公式f=As×Ci/（Ai×Cs）（式中Ci为芫花素浓度，Ai为芫花素峰面积，Cs为待测组分浓度，As为待测组分峰面积）计算芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素的相对校正因子分别为f芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷/芫花素=1.62、f芹菜素/芫花素=0.98。

2.5.2 待测成分的色谱峰定位 采用待测成分与芫花素保留时间的相对值作为定位标准，考察在不同柱温、流速、色谱柱及色谱仪下对芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素相对保留时间的影响，结果各待测组分相对保留时间RSD均小于5%，表明方法重现性良好，结果见表4。

2.5.3 校正因子重现性考察 考察校正因子在不同实验室环境下的重现性，取同一份样品，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，于不同实验日期，在不同柱温、流速、色谱柱及色谱仪下对校正因子进行考察，不同条件下芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素的校正因子波动3%以下，表明方法重现性良好，结果见表4。

表4 3种成分重现性考察结果

2.6 样品测定结果 取芫花药材15批，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件分析，分别采用外标法（ESM）及一测多评（QAMS）法对芫花素、芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素的含量进行计算，并计算两种方法的相对平均偏差（RE%）。结果显示两种方法测得的数据无明显差异，相对平均偏差小于3%，结果见表5。

表5 样品ESM及QAMS测定结果

2.7 不同产地芫花药材的聚类分析 对上述15批不同产地的芫花药材的内标法测定结果进行分析，通过SPSS 20.0版软件进行系统聚类，得到聚类分析结果见图2。从图2可知，欧氏距离等于5时，可将15批芫花药材分为5类，其中来自河北省的3批S3、S11、S12为第一类，其中来自广西省玉林市和广东省广州市的5批S1、S2、S4、S5、S6为第二类，来自江西的3批S8、S9、S10为第三类，来自四川省成都市的3批S13、S14、S15为第四类，来自广西省玉林市的1批S7，单独成一类，将其作为离群数据处理。上述结果说明不同样品之间存在明显的产地差异性。

图2 芫花药材聚类分析结果

2.8 不同产地芫花药材的主成分分析 用SPSS 20.0软件对15批样品内标法含量测定所得结果进行主成分分析，得出相关矩阵的特征值及方差分析，结果见表6。主成分1与主成分2的特征值分别为2.089和0.706，对于总方差的累积贡献率达93.164%，基本保留了原样本信息，所以确定提取的主成分数为2个。根据主成分载荷矩阵表7可知，芹菜素和芫花素对主成分1的影响最大，芹菜素-7-O-β葡萄糖醛酸苷对主成分2的影响较大。以2个主成分（见表8）分别作为X、Y轴得15个样品的主成分得分图，可以将15批样品分为5类，其中来自河北省的3批S3、S11、S12为第一类，来自广西省玉林市和广东省广州市的5批S1、S2、S4、S5、S6为第二类，来自江西的3批S8、S9、S10为第三类，来自四川省成都市的3批S13、S14、S15为第四类，来自广西省玉林市的1批S7，单独成一类，将其作为离群数据处理，与聚类分析结果一致（见图3）。计算各样品综合得分并排序，结果表明，来自于广西省玉林市、广东省广州市和四川省成都市的芫花药材质量排名均优于河北省安国市、江西省宜春市。（见表9）

图3 主成分得分图

表6 特征值及方差分析

表7 主成分载荷矩阵

表8 主成分得分、综合得分及排名

表9 5个产地芫花主成分得分均值、综合主成分得分均值及排名

综上，进一步分析各类之间的含量配比，以芹菜素-7-Oβ-葡萄糖醛酸苷∶芹菜素∶芫花素三者含量比例关系来看，第一类约为5∶1∶1，第二类约为2∶2∶1，第三类约为3∶1∶1，第四类约为3∶2∶1，第二类和第四类样品的芹菜素含量占比均较高，该两类样品分别来源于广东、广西、四川；在主成分分析结果中，芹菜素的特征值为0.913，为影响芫花药材质量的关键因素；从地理位置来看，四川、广西和广东的海拔均高于河北和江西，且四川、广西和广东均属于亚热带季风气候，适宜芫花的生长。上述3个产地的样品均排名前三，质量较好，含量结果与主成分分析结果一致，提示药材化学成分的比例可能与其生长环境有一定的关联。

3 讨 论

3.1 分析方法的确定2015年版《中华人民共和国药典》芫花项下含量测定以芫花素为指标，文献研究指出芫花素在芫花的不同部位均有分布，且芫花素是芫花泄水逐饮，镇咳祛痰的主要成分[11]，因此，选择芫花素作为内标，建立一测多评法测定3种黄酮类成分的含量。本实验考察了前处理方法中不同条件对3种成分含量的影响，最终确定最优的条件为：料液比为0.2∶25 g/mL，以70%乙醇作为提取溶剂，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）30 min，重复提取2次。

3.2 一测多评法 本研究通过建立一测多评的方法，测定15批芫花的芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷含量范围在6.314～12.633 mg/g、芹菜素含量范围在2.416～6.565 mg/g、芫花素含量范围在2.018～3.659 mg/g，并对不同成分之间的含量比例关系与主成分分析结合进行分析。结果显示，四川、广西和广东产地的芫花质量优于河北和江西，表现为整体质量优、品质佳，可作为芫花基地规范化种植及优良种质筛选的优选区域。

3.3 聚类分析和主成分分析 聚类分析将15批样品分为五类，利用主成分分析法，将3个峰变量降维为2个主成分变量，用主成分1和主成分2分别作为X、Y轴得15个样品的主成分得分图，结果与聚类分析一致。计算各样品综合得分并排序，结果表明，来自广西省玉林市、广东省广州市和四川省成都市的芫花药材质量优于河北省安国市和江西省宜春市药材质量。经分析，芫花的质量可能与海拔、生长年限及采收加工有关，为芫花原药材的产地优选提供参考。

本研究建立的一测多评法同时测定芫花中3种活性成分的含量，为更好评价芫花药材质量提供了参考，并为优选芫花产地提供了实验依据。