多菌种混合发酵果蔬汁的研究进展

朱丹实，吴逗逗，沈雨思，蔡 天，白梧桐，曹雪慧，刘 贺

（渤海大学食品科学与工程学院 生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心 辽宁锦州 121013）

果蔬是人们日常饮食中不可或缺的一部分，富含维生素、矿物质、氨基酸以及膳食纤维等多种营养物质。果蔬汁以其较高的营养价值和食用方便的特点深受消费者喜爱，果蔬汁类产品的消费需求逐年增长[1]。近年来，随着人们健康意识的提高，绿色、天然的果蔬制品越来越受到消费者的青睐，发酵果蔬汁就以其独特的品质优势脱颖而出。发酵后的果蔬汁风味更加丰富[2-4]，营养更加均衡[5-6]。

随着研究深入，学者发现与单一菌种发酵果蔬汁相比，多种菌种协同发酵可以使发酵果蔬汁营养更加丰富[7]。目前，混合发酵菌剂逐渐受到研究人员的关注。混菌发酵果蔬汁借鉴“果蔬酵素”的发酵方式[8]，以一种或多种果蔬（果蔬汁）为原料，利用多菌种发酵，如：乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等，生产富含多种营养物质并具有多种功能性的饮料。果蔬汁经多菌种协同发酵，其风味[9-10]、营养[5，11]以及贮藏品质[12]获得改善。本文重点论述发酵菌种特性及混菌发酵对果蔬汁风味、功能性和贮藏品质的影响机制，以期为混菌发酵果蔬汁的开发与品质提升提供参考。

1 发酵果蔬汁的产品特性

发酵果蔬汁中的微生物利用原料中的营养物质进行自身物质代谢，通过微生物与微生物、微生物与底物之间的相互作用以及多种复杂的代谢过程，促进多种生物活性物质的产生，如有机酸、胞外多糖、蛋白酶等[13]。发酵可以提升果蔬汁的风味、口感、营养价值和货架期等各方面性能[14]。

发酵赋予果蔬汁独特的风味。Chen 等[15]利用4 种乳酸菌发酵苹果汁，经发酵和贮藏后，与苹果汁典型香气有关的大多数挥发性化合物都得以保留或富集，并且乳酸菌发酵产生了乙醛和一些新的酮类化合物，增加了重要的芳香族成分。Lee等[16]利用不同比例的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 和土星拟威尔酵母（Williopsis saturnus）混合发酵木瓜汁发现，一定比例下的复合菌种可以改善木瓜酒的风味。Chen 等[17]利用耐乙醇的醋酸菌发酵西瓜汁发现，这种方式可以提高西瓜醋中的有机酸、游离氨基酸和酯类化合物的含量，从而改善西瓜醋的整体风味和接受度。

发酵后果蔬汁功能性显著提高。Dámaso 等[18]招募了7 名志愿者进行随机、对照和交叉研究，结果表明，发酵橙汁饮料含有丰富的生物可利用类胡萝卜素，经常饮用对健康有益。Li 等[19]研究了植物乳杆菌（Lactobacillus plantarumNCU116）发酵胡萝卜汁对高脂饮食和低剂量链脲霉素（Streptozocin，STZ） 诱导的Ⅱ型糖尿病大鼠血清代谢物的影响。研究发现，乳酸菌发酵处理显著改变了脂类、脂蛋白、嘌呤、色氨酸、脂肪酸生物合成、糖酵解和糖异生等生物通路和过程。刘涛等[20]利用多种有益菌发酵桑葚汁得到酵素，在发酵过程中桑葚汁的有机酸含量和总酚含量持续上升，最终制得抗氧化活性高、营养丰富的产品。Kwaw 等[21]发现发酵可以显著提高桑葚汁中酚类化合物的含量，桑葚汁经发酵后，自由基清除活性明显增强。发酵诺丽果汁也具有明显的抗氧化活性，这可能与发酵诺丽果汁中的酚类化合物有关[22]。

2 发酵菌种对果蔬汁品质的影响

果蔬汁发酵常用到的菌种有乳酸菌、酵母菌和醋酸菌等。这些菌种在发酵过程中可以利用果蔬汁原料，通过自生代谢生成多种中间有机物和代谢产物[23]。根据产品口味和功能性要求不同，果蔬汁的原料和菌种有所不同。表1列举了部分市场上销售的果蔬汁产品及其菌种。可见，目前市场上发酵果蔬汁产品利用的菌种以乳酸菌为主。

表1 市场上部分发酵果蔬汁产品Table 1 Some fermented fruit and vegetable juice products in market

2.1 乳酸菌

乳酸菌作为一类能够对宿主生理功能产生有益作用的活性微生物，数量巨大。绝大部分乳酸菌是人体内必不可少且具有重要生理功能的菌群，广泛存在于人体的肠道中[24]。乳酸菌有很多生理功能，例如：调节肠道菌群平衡，促进营养吸收，调节免疫系统，抗老、抗癌等。

乳酸菌应用于发酵果汁、发酵植物蛋白饮料等[25]，可以提高果蔬汁的营养价值以及保藏性能。研究表明，利用干酪乳杆菌发酵鲜龙眼果肉，制得的龙眼果汁中的多糖含量、总多酚含量均得到提升[26]。Pereira 等[27]发现，腰果梨汁经乳酸菌发酵后，抗氧化活性和总酚在贮藏过程中的保持率均大于未发酵梨汁。红枣汁经德氏乳杆菌发酵后，随着贮藏时间的延长，红枣汁的色泽更加透亮[28]。

乳酸菌发酵还可以使果蔬汁的风味得到提升[29]。Cagno 等[30]利用植物乳杆菌发酵石榴汁，发现发酵后石榴汁中理想化合物（如醇类、酮类和萜烯类）的浓度增加，而非理想化合物醛类的浓度下降。Kaprasob 等[31]以植物乳杆菌、干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌为研究对象，对腰果苹果汁（CAJ）中的生物活性物质和风味挥发物进行研究，结果表明，发酵改变了CAJ 的风味，果味虽然降低，但增加了威士忌风味和酸味。苹果汁经6 种精选乳酸菌发酵后，生成了7 种新的醇类和6 种新的酯类化合物，并且酮和醛的含量也有所提高[32]。

2.2 酵母菌

酵母是兼性厌氧的单细胞真菌，在有氧条件下可以大量繁殖，在无氧条件下可以把糖类代谢成酒精和二氧化碳[33]。酵母菌与人类关系密切，是工业上最重要、应用最广泛的一类微生物，在酿造、食品、医药工业等方面占有重要地位。

酵母菌能利用果汁中的糖类供自身生长繁殖，同时厌氧发酵产生酒精，得到果酒。果酒还可以进一步好氧发酵得到果醋。因此，可以充分利用我国的果蔬资源，提高经济效益。果酒中的多糖、有机酸、酚类物质等成分都是功能性化合物，具有抗氧化活性，降胆固醇，预防心血管疾病等作用[34]。Escudero-lópez 等[35]发现，相较于橙汁、酒精或水来说，饮用橙子酒能显著降低小鼠患心血管疾病的风险。

果蔬汁经酵母菌发酵后，其感官风味劣变程度较小，还具有一定的增香作用[36]。芒果胡萝卜果汁在酵母菌发酵过程中，主体香气成分由萜烯类逐渐转变为酯类，最终得到色泽橙黄饱满、透明清亮、具有浓郁果香和酒香、口感甘甜醇厚的芒果胡萝卜果酒[37]。Varela 等[38]利用两种对葡萄糖转化为乙醇效率较低的葡萄酒酵母发酵葡萄汁，得到酒精度低而风味良好的优质葡萄酒。酵母菌发酵果蔬汁不仅保留了果蔬原有的芳香，还增加了陈酿的香味[37]。

2.3 醋酸菌

醋酸菌作为一类革兰氏阴性、好氧性杆菌，从其发现至今，其分类地位和名称经过了多次变更和修订。目前，人们将醋酸菌分为醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属两类[39]。果蔬汁是醋酸菌良好的发酵基质，许多果蔬原料均能被醋酸菌利用进行果醋发酵。适量的醋酸可以提高果蔬汁的营养和风味，并抑制腐败菌的生长[13]。

果醋中含有丰富的有机酸、氨基酸、维生素，以及多酚、黄酮等抗氧化成分，具有调节体内酸碱平衡、抑菌、降脂、减肥、降血糖、抗氧化、抗疲劳等生理功能。Yagnik 等[40]发现苹果醋可直接对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌等致病菌产生抗菌作用。苹果醋还可以减少单核白细胞感染时诱导的炎症性细胞因子的释放，增加单核细胞的吞噬能力。其抑菌机制包括：微生物蛋白生理性改变，破坏结构致病性蛋白和对代谢酶有影响等。徐伟等[41]通过动物实验研究表明，利用多菌株共生发酵制得的蜂蜜醋饮料，具有减肥、预防动脉硬化及降血脂作用。

醋酸菌与其它菌种协同发酵，既能提升果蔬汁的营养价值还能丰富果蔬汁的口感。醋酸菌与酵母菌混菌发酵芒果汁，可以得到色泽均匀、金黄、酸味柔和、不刺激、具有芒果独特香味和醋香的芒果醋[42]。利用酵母菌或乳酸菌对果蔬汁原料进行发酵，再经醋酸发酵酿造，可以得到被誉为“第四代饮料”的果醋[43]。

3 多菌种混合发酵果蔬汁及影响机制

目前，关于单一菌种在果蔬汁发酵中的应用研究相对较多，而多菌种混合发酵果蔬汁的研究较少。混菌发酵相对于单菌发酵而言，代谢机制更加复杂，发酵产物更加丰富。陈思奇等[44]采用嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilusGIM.1.208）、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosusCICC.22210）和生香酵母混菌发酵刺梨果渣。研究发现，混菌发酵后果渣的风味更加协调、柔和。何翠婵[45]研究表明，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarumLPL134-1-P）和酒酒球菌（Oenococcus oeni6066）能有效降解青梅汁中的苹果酸和柠檬酸，实现降酸的目的。李建强等[46]分别以单一水果和综合果蔬为原料，利用酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等微生物协同发酵，发现混菌发酵能提高酵素的SOD 活性。Chen 等[47]在柑橘醋酿造过程中，利用酿酒酵母和植物乳杆菌混合发酵柑橘汁，研究表明，混合发酵比纯酿酒酵母发酵时的抗氧化活性更高。

混菌发酵体系中不同的菌株组合，可以通过彼此之间的共生或互生作用的营养利用，克服中间产物积累过多，而对终产物生成带来的不利影响[13]。Bahareh 等[48]发现微生物生态相互作用是决定单个菌种对发酵结果贡献的主要因素，而不仅仅是物理化学作用。研究数据表明，发酵胁迫会导致每个菌种的个体反应，然而这种反应在很大程度上受到生态系统中菌种之间相互作用的影响。

3.1 混菌发酵对果汁风味的影响

果蔬汁中含有丰富的游离氨基酸、脂肪酸、有机酸和糖类等物质，微生物在果蔬汁中发酵代谢时，可以利用这些物质作为前体物质进行风味物质的合成。微生物利用果汁中的氨基酸进行代谢可以形成果汁所特有的果香和酯香；利用游离脂肪酸可以生成果蔬汁中的许多挥发性成分，比如C6和C9醇、醛、酯等；利用糖可以合成各种酮类和酯类等物质[14]。果蔬汁经多菌种协同发酵后，风味可以得到很大改善。果蔬汁中多种物质的分解，多种挥发性成分的合成需要有多种不同性能的酶系参与，众多的酶系需要多种菌株产生[49]。

混菌发酵得到的果醋口感更加丰富，香气更加协调。一般来说，果醋的混菌发酵有3 种方式：一是在果醋的酒精发酵阶段除了酿酒酵母外引入非酿酒酵母；二是在酒精发酵阶段引入乳酸菌或其它菌种；三是在醋酸发酵阶段引入乳酸菌或其它菌种。混菌发酵果醋的流程图见图1。

图1 多菌种复合发酵果醋过程Fig.1 Fermentation process of fruit vinegar by multiple strains

第1 种方式，在果醋的酒精发酵阶段采用酿酒酵母和非酿酒酵母协同发酵，这种方式较为常见。可以使制备的果醋含有丰富的有机酸，并生成鲜味和甜味游离氨基酸，同时还可以提高果醋的果香和花香。Liu 等[50]在苹果醋的酒精发酵阶段利用热带假丝酵母（Candida tropicalis）和芳香酵母（Aromatizing yeast）进行混菌发酵，研究表明，混菌发酵可以提高苹果醋的总有机酸、总酯、总醇和总酚类物质含量。Hu 等[51]利用汉逊酵母（Hanseniaspora uvarumYun268） 和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）混合发酵葡萄汁，发现混菌发酵能够提高葡萄汁中链脂肪酸（MCFA）乙酯的含量。中链脂肪酸乙酯是酵母的次生代谢物，能够增强葡萄汁的温和果香，对食品饮料的果香有重要作用。利用非酿酒酵母和酿酒酵母混合发酵，能够提高中链脂肪酸含量，从而提高中链脂肪酸乙酯的含量，同时又不会使乙酯浓度超过不可接受的限度。

第2 种方式，在酒精发酵阶段引用乳酸菌等菌种，使酵母菌和乳酸菌同时发酵。这样可以提高果醋中有机酸的种类，削弱乙酸带来的刺激口感，使果醋的口味变得丰富柔和，感官品质得到改善。荣智兴[52]在蓝莓醋的发酵过程中引入乳酸发酵，利用乳酸菌和酵母菌混和发酵蓝莓汁，使酒精发酵和乳酸发酵同时进行，发现多菌种混合发酵能够提高蓝莓醋的感官评分。Wu 等[53]通过宏基因组测序的方法来阐明自然发酵果醋中与风味有关的关键微生物的原位代谢网络，发现由多种菌种自然发酵的果醋含有更加丰富的风味物质。酵母菌和乳酸菌复合发酵时产生一定量的乙醇，可以促进醋酸菌的发酵，增加酸的种类和有机酸含量，这可以提高果蔬汁的营养价值并改善其风味。

第3 种方式，借鉴传统食醋的发酵方法，在果醋的乙酸发酵阶段引用乳酸菌或其它菌种以改善果醋的刺激性口感，使果醋口味柔和绵长。田璐等[54]在柿子皮果醋的发酵过程中发现，当氧化葡萄糖酸杆菌与植物乳杆菌共同发酵时，成品果醋的柿香和醋香浓郁、协调，并伴随淡淡乳香气味。将乳酸菌和醋酸菌共同培养，结果显示混合发酵体系能促进香醋中2，3-丁二酮等风味物质的产生[55]。当乳酸菌或其它菌种与醋酸菌协同发酵时，会形成醋酸、乳酸、柠檬酸等物质，这对果醋风味品质的提升具有重要作用。

对于果酒来说，利用酿酒酵母和非酿酒酵母混菌发酵果汁，可以增加果酒中有利于风味形成的酯类化合物的含量，这也是多菌种协同代谢作用的结果。Renault 等[56]为了研究德布尔有孢酵母（Torulaspora delbrueckii）与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）混合发酵对果汁酒精发酵过程中果酒酯类形成和芳香风味的影响，研究团队将两种酵母按顺序混合发酵与同时混合发酵得到的果酒，以及两种酵母单一发酵得到的果酒进行分析比较。研究表明，与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）单一发酵相比，混合发酵能够增加由德布尔有孢酵母（Torulaspora delbrueckii）产生特定酯的含量（丙酸乙酯、异丁酸乙酯和二氢肉桂酸乙酯），且这些酯被认为是德布尔有孢酵母的活性标记物。另一方面，在混合发酵期间，由于两种酵母之间的积极相互作用，乙酸异丁酯和乙酸异戊酯的浓度规律性增加。混合发酵果酒中，丙酸乙酯、异丁酸乙酯、二氢肉桂酸乙酯和乙酸异丁酯的含量增加，是增加果酒复杂果味的主要原因。

3.2 混菌发酵对果汁功能性的影响

混菌发酵后的果蔬汁含有维生素、酶类、氨基酸、矿物质等多种活性功能成分。这些活性成分赋予了果汁多种功能特性，如：维持体内营养平衡，提高自身免疫力，延缓衰老，抗氧化，消炎抑菌等[7]。从功能性上看，乳酸菌主要是代谢果蔬汁中的酚类物质，使其转化为具有较高的生物可利用性和生物活性的小分子酚类化合物[57]，并将果蔬汁中的不溶性膳食纤维降解为可溶性膳食纤维[58]。酵母菌可以分泌丰富的蛋白酶、淀粉酶[59]。醋酸菌可以发酵生成醋酸，破坏致病微生物的结构蛋白和代谢酶[40]。

混菌发酵时，借助微生物间的互生关系，可以使各种微生物活性增加。Yan 等[60]利用鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosusGG） 和植物乳杆菌（L.plantarum-1）发酵蓝莓果渣，发现混菌发酵组比单一菌种发酵组的生物活性更高。混菌发酵过程中，通过代谢产物的相互作用，也可以得到更加丰富、含量更高的代谢产物。大量研究表明，混菌发酵比单一菌种发酵的果蔬汁可以得到更多的功能性成分，部分研究结果如表2所示。

表2 混菌发酵对果蔬汁功能成分的影响Table 2 Effects of mixed fermentation on functional components of fruit and vegetable juice

混菌发酵的果蔬汁含有更高的酚类和黄酮类化合物。蓝莓果渣经混菌发酵后，总酚和黄酮类化合物含量增加，抗氧化活性得到提高。混菌发酵后的蓝莓果渣的降胆固醇能力及抗疲劳活性有所提高[60]。魏文浩[63]利用酵母菌和红曲霉混菌固态发酵番石榴叶时发现，混菌发酵后，番石榴叶汁的总黄酮和总多酚含量均有所提升，尤其是芦丁、异槲皮苷、槲皮素、山奈酚的含量大幅提高。混菌发酵使果蔬汁中的酚类物质和黄酮类物质更加丰富，抗氧化剂物质结构更加稳定。一些酚类物质可以通过疏水结合作用降低胆固醇含量，增加胆固醇的排泄，还可以限制体内过多的自由基，减少人体运动引起的氧化应激反应。果蔬汁中酚类和黄酮类物质含量的升高，使混菌发酵后的果蔬汁的降血脂、抑菌、抗癌、延缓衰老等功能增强。

几种不同的菌种在发酵过程中不仅会促进彼此间产物的合成，还可以得到更多的功能性酶类。随着发酵过程中微生物的生长，微生物细胞不断破裂释放出相应的功能酶，导致产物的各种功能酶活性增加，抗氧化活性得到提高。莫大美等[64]利用乳酸菌、酵母菌和醋酸菌混菌发酵玫瑰汁，得到一种色泽艳丽，酸甜适口的玫瑰产品，且这种产品的超氧化物歧化酶（SOD 酶）活性高于单菌发酵。孙淑夷[61]利用葡萄酒酵母、果酒酵母、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌混菌发酵荔枝汁，研究表明，混菌发酵产物的SOD 酶活性和淀粉酶活性更高，且发酵完成后，荔枝汁的各种酶活性都有所提高，总酚含量也有所提高。当果蔬汁由酵母菌、乳酸菌和醋酸菌协同发酵时，酵母菌首先消耗体系内的氧气，分解营养物质，为乳酸菌提供氨基酸、维生素等营养因子，使得发酵液SOD 酶活性和总酸含量上升。

混菌发酵还可以得到更多的膳食纤维。曹艳等[60]采用混菌发酵联合分段控温工艺，利用青霉菌和植物乳杆菌混菌发酵橘皮渣，研究发现，混菌发酵后产物中可溶性膳食纤维含量和总膳食纤维含量都大幅提高。黄凤玲等[65]比较红枣果汁果渣和果酒果渣的膳食纤维功能特性，发现红枣果酒果渣膳食纤维的功能特性均显著高于果汁果渣膳食纤维的功能特性。果渣经霉菌和乳酸菌协同发酵，乳酸菌在发酵过程中产生大量的乳酸，使纤维素的糖苷键断裂，破坏其结构，使其暴露出更多的纤维素酶作用位点；而青霉菌能够分泌纤维素酶，具有很强地分解纤维素的能力，从而使混菌发酵后的果渣的可溶性膳食纤维含量和总膳食纤维含量得到提高。同时果渣经多菌种协同发酵还会改变膳食纤维的结构，使其结构疏松，比表面积增加，亲水、亲油基团暴露，从而增加膳食纤维的膨胀力、持水力、持油力、吸附胆固醇能力等。

3.3 混菌发酵对产品贮藏品质的影响

混菌发酵能提高果蔬汁中功效性成分的化学稳定性，改善其贮藏品质。经多种微生物发酵后，果蔬汁体系内产生一定量的酸，酸性环境可以使酚类物质[66]、抗坏血酸、花青素等保持结构稳定，同时果蔬汁内一些物质的结构会发生变化，转化为更稳定的结构[13]。白烨[67]在柑橘果醋的酒精发酵阶段引入乳酸菌，研究发现，发酵过程中引入乳酸菌能影响柑橘果醋的多酚类物质含量以及果醋的抗氧化性。果蔬汁在混菌发酵过程中可以产生大量的有机酸，使其总酸升高，这会使多酚氧化酶等物质失活，从而使酚类物质结构更加稳定；果蔬汁本身含有一定量的酚类物质和黄酮类物质，混菌发酵可以使这些物质的复杂结构被分解成更简单的结构，有利于这些生物活性物质的释放，增强产品的生物活性。

在贮藏期间，混菌发酵果蔬汁的风味损失较小。Zubaidah 等[68]利用红茶菌（乳酸菌、酵母菌和木醋杆菌的混合菌群）发酵蛇果汁，研究发现，混菌发酵能改善蛇果汁的颜色和风味，增强抗氧化性和抗菌性，提高其贮藏品质。马得草[69]利用酿酒酵母和非酿酒酵母混菌发酵葡萄汁，研究表明，两种酵母混菌发酵能够增加葡萄酒香气的强度和持久度。非酿酒酵母比酿酒酵母更能激发浆果的酿造潜力，然而该类酵母对环境的耐受性比较差，往往在发酵前期就会逐渐死亡，因此两种酵母协同发酵能够提高果酒的品质。而且两种酵母混菌发酵期间能使果酒中的糖苷酶的整体活性得到提高，从而使香气前体物质充分水解，进一步提高果酒香气的强度和持久度。

果蔬汁容易被其它的杂菌污染，而添加几种益生菌后，其协同发酵可以产生一些对有害菌有抑制作用的产物，如：过氧化氢、细菌素、双乙酰等[70-71]。Alegre 等[72]发现在苹果制品的整个贮藏过程中，利用鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosusGG）抑制沙门氏菌和单核增生李斯特菌，进而延长果蔬制品的贮藏期。Spinler 等[73]研究发现罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri） 能生成一种有效的广谱抗菌化合物——罗伊氏菌素，可以抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌等。食品中的微生物群通常是由混合菌种组成，一种菌的活性可能会影响其它菌种的生长和活性。菌种间相互拮抗或益生菌抗菌活性机制在有益微生物和潜在致病微生物的竞争中起到重要作用。

4 结语

混菌发酵果蔬汁作为一种功能性饮品，因其多菌种协同发酵作用，使饮品具有更丰富的风味和柔和的口感，含更多的活性功能成分，同时还可以使产品保持较高的贮藏品质。目前关于混菌发酵果蔬汁机制的研究较少，尚缺乏系统的体系来阐明混菌发酵果蔬汁的发酵机理。多菌种复合发酵是一个复杂的过程，涉及到发酵过程中菌种的基因表达以及菌种之间的相互作用。在今后的研究中，需要从混菌发酵的原料、菌种以及菌种之间的组合等方面进行合理的分类探讨，并从生理、代谢和遗传角度来研究复合菌种的协同作用机制，以便开展更深层次的研究。