马杜罗茄衣发酵过程中外观颜色和内在成分的变化及相关性分析

丁宁，丁松爽，胡捷，吴创，王荣浩，时向东*

1 河南农业大学，烟草学院，河南省郑州市金水区农业路63号 450002；

2 湖北中烟工业有限责任公司三峡卷烟厂，湖北省宜昌市夷陵区黄金路46号 443100

茄衣是外观判断雪茄品质和风味特征的依据之一，一般认为茄衣颜色由浅至深代表着雪茄口感由清淡至浓郁[1]。马杜罗茄衣是一种特殊类型的茄衣，其色泽油亮、颜色较深、身分偏厚，往往被用作纪念版或限量版等高档雪茄的茄衣，并逐渐成为近年来国际上雪茄的流行色，以表明雪茄的醇厚口感。

烟叶的颜色是其化学成分与质量的外在表现[2]。近年来，研究人员通过基于CIE色度学理论的计算机图像处理和色差计对烟叶颜色进行量化，发现烟叶表面颜色参数变化与内在化学物质及质体色素之间存在显著的相关性[3-6]。但迄今为止，针对雪茄茄衣外观颜色变化的研究主要集中在烟叶调制阶段，对于发酵期间茄衣颜色的变化情况未见报道[7-9]，而马杜罗茄衣正是通过后期深度发酵才体现出其特殊的品质特点的。发酵可以促进茄衣内含物质进一步转化，使茄衣颜色变深、油润感和光泽感提高，烟叶内在化学成分更为协调，抽吸醇厚感增加[10]。海南3号品种茄衣颜色厚重、油分充足、耐发酵性好，是优质的马杜罗茄衣原料。本文以海南3号为试验材料，研究了马杜罗茄衣发酵过程中颜色参数值及化学成分、质体色素的变化，并对马杜罗茄衣颜色形成因素进行相关分析，旨在为优化马杜罗茄衣发酵工艺提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验在海南儋州光村雪茄烟种植基地进行，植烟土壤类型为砂壤土。供试雪茄烟品种为海南3号，遮阴种植。田间管理、采收、调制、初次发酵按当地《马杜罗茄衣生产技术规程》进行。

1.2 试验方法

按照海南建恒哈瓦那雪茄有限公司《雪茄烟叶分级标准》对已完成初次发酵的烟叶进行精确分级，得到茄衣等级的烟叶，保证等级内纯度一致。对茄衣等级烟叶进行再次分选，得到3种厚度的茄衣，即：薄茄衣（厚度0.020～0.035 mm）、中厚茄衣（厚度0.035～0.050 mm）、厚茄衣（厚度0.050～0.065 mm），每个处理各7 kg。对烟叶进行回潮处理，控制烟叶含水率为26%±1%。而后将烟叶置于恒温恒湿箱内进行二次发酵。发酵温度设置为45℃，湿度为80%。自发酵之日开始取样，每隔5 d取一次，每次1 kg，直到30 d发酵结束为止。

1.3 测定方法

1.3.1 茄衣颜色测定

在每次取出的样品中，挑选具有代表性的10片烟叶，进行颜色参数测定。采用HP-C210色差仪，先对仪器进行黑白版校正，在烟叶一侧叶缘与主脉间的中点所连成的曲线上，分别于叶长的1/3、1/2和2/3处进行测定，每片烟叶两侧共测定6个位点。测量时将烟叶正面朝上置于黑色背景板上，取点时保证烟叶平展。测定的色度学指标包括L*值（明度值）、a*（红绿色度值，正值代表红色度，负值代表绿色度） b*值（黄蓝色度值，正值代表黄色度，负值代表蓝色度），并计算C值（饱和度）、H值（色泽比）和H°值（色相角）。计算公式为：

饱和度（C）=（a2+b2）1/2；色泽比 （H）= a/b；色相角（H°）= arctan（b/a）。

1.3.2 茄衣化学成分测定

总糖、还原糖、总氮、烟碱、钾、氯含量的测定采用流动分析法[11]，叶绿素、类胡萝卜素含量的测定采用分光光度法[12]，每次测定重复3次。

1.3.3 数据分析

采用Microsoft Excel 2010、SPSS24.0和Origin2018进行数据处理、统计分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 茄衣烟叶发酵过程中颜色参数值的变化

由图1可知，三个处理烟叶颜色参数值随发酵进程的推进呈波动下降的趋势。就明度值L*（图1-A）而言，茄衣身份越厚明度值越低，并且在发酵过程中明度值下降趋势也越平缓。发酵前后相比，薄、中厚、厚茄衣明度值均有极显著差异，说明发酵促使烟叶颜色转深。进一步分析发现，烟叶红绿值a*（图1-B）与黄蓝值b*（图1-C）的变化情况与明度值L*略有不同，即在发酵20 d或25 d达到最低值后稍有回升。

图1 发酵过程中茄衣烟叶颜色参数值的变化Fig. 1 Changes of color parameter values of wrapper tobacco leaves during fermentation

其中，厚茄衣a*、b*值最低点均出现在发酵25 d，此后依次回升11.5%和3.2%。色相角H°、饱和度C、色泽比H由L*、a*、b*值计算得出，发酵期间烟叶色相角与色泽比波动较大，饱和度前期下降后期升高，与a*、b*的变化趋势相一致。

2.2 茄衣烟叶发酵过程中化学成分的变化

由图2可知发酵过程中，不同厚度茄衣烟叶的化学成分变化较为一致。就相对含量而言，同一发酵天数时，烟叶总糖、总氮、烟碱含量在不同处理间排序为：厚茄衣＞中等茄衣＞薄茄衣，而钾含量情况与之相反，薄茄衣含量最高。较厚的烟叶虽然内含物质丰富，但钾含量较低，生产中使用茄衣时应考虑品质特征与燃烧性的协调。随着发酵的进行，水溶性总糖含量逐渐降低（图2-A），而还原糖含量先升高后下降（图2-B）。说明在发酵的前中期大分子糖类物质水解速率较快，还原糖生成量高于转化量。茄衣烟叶氯含量在发酵期间的变化趋势不明显，但发酵后含量显著高于发酵前（图2-F），这是烟叶本身干物质的量经发酵后降低所导致的。

图2 发酵过程中茄衣烟叶化学成分含量变化Fig. 2 Changes of contents of chemical components in wrapper tobacco leaves during fermentation

2.3 茄衣烟叶发酵过程中质体色素含量的变化

图3为发酵过程中茄衣烟叶质体色素含量的变化。可以看出，各类质体色素含量均随发酵的进行呈现降低的趋势。其中，叶绿素a、b含量在发酵过程中始终表现为薄茄衣＞中等厚茄衣＞厚茄衣。进一步比较发现，三类茄衣叶绿素a及类胡萝卜素含量变化相似，即薄茄衣与中等厚茄衣质体色素含量下降速度较大，且呈现“快—慢—快”的特点；厚茄衣质体色素含量降幅较低，其值依次为17.1%和29.5%。

图3 发酵过程中茄衣烟叶质体色素含量的变化Fig. 3 Changes of plastid pigment content in wrapper tobacco leaves during fermentation

2.4 茄衣烟叶发酵过程中颜色参数与化学成分及质体色素含量的关系分析

2.4.1 描述性统计分析

从表1可以看出，按照变异系数划分等级：总氮、氯、钾及颜色参数中的L*、b*、C、H°为弱变异性（变异系数≤10%），其余指标为中等变异性（变异系数在10%～100%）[16]。类胡萝卜素的偏度稍大，其余指标偏度值绝对值均小于1，基本符合正态分布。

表1 茄衣烟叶化学成分、质体色素含量和颜色指标等变量的描述性统计分析Tab. 1 Descriptive statistical analysis of variables such as chemical composition, plastid pigment content and color index of wrapper tobacco leaves.

2.4.2 简单相关分析

为研究茄衣发酵过程中产生颜色变化的原因，进行了茄衣烟叶颜色参数与化学成分、质体色素含量之间的相关性分析（表2）。结果表明，各项颜色指标与多种化学成分、质体色素间存在相关性。其中，明度值（L*）分别与还原糖、总氮和烟碱含量呈极显著和显著负相关，与钾、叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量均呈极显著正相关。说明随着还原糖、烟碱、总氮含量的升高，烟叶颜色变深，随着钾、质体色素含量的升高，烟叶颜色变浅。红绿值（a*）与总糖含量呈极显著正相关，与烟碱含量呈显著正相关；黄蓝值（b*）与总氮含量呈极显著负相关，与叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量均呈极显著正相关。而各项颜色参数与氯含量间相关性不显著，说明氯含量对烟叶颜色的影响较小。

表2 发酵过程中烟叶颜色参数与化学成分及质体色素含量间的简单相关系数Tab. 2 Simple correlation coefficient between tobacco leaf color parameters, chemical composition and plastid pigment content during fermentation

2.4.3 典型相关分析

为进一步分析茄衣颜色变化与化学成分的关系，采用SPSS24.0对发酵过程中茄衣烟叶的总糖(X1)、还原糖(X2)、烟碱(X3)、总氮(X4)、钾(X5)、叶绿素a(X6)、叶绿素b(X7)、类胡萝卜素(X8)与L*(Y1)、a*(Y2)、b*(Y3)、C(Y4)、H(Y5)、H°(Y6)等颜色参数进行典型相关分析（表3）。

表3 茄衣烟叶发酵过程中颜色参数与化学成分及质体色素含量的典型相关分析Tab. 3 Typical correlation analysis of color parameters, chemical components and plastid pigment content during the fermentation process of wrapper tobacco leaves

续表3

表3显示，茄衣颜色参数与化学成分和质体色素含量的典型相关分析提取到6组典型变量，其中，第1组典型变量的相关系数达为0.988，达到极显著水平（P<0.01），第2组典型相关系数为0.920，达到了显著水平 （P<0.05），其余组不显著。

得第1组典型变量为：

u1=0.4 9 7 X1+0.0 8 6 X2-0.2 9 9 X3+0.1 6 9 X4-0.402X5+1.014X6-0.093X7+0.332X8；

v1=0.915Y1-5.003Y2+0.235Y3+3.447Y4+2.48Y5-0.913Y6。

在典型变量（u1，v1）中，u1代表了茄衣烟叶的化学成分和质体色素含量情况，由u1与原始数据的相关系数可知，X4（-0.889）、X6（0.939）、X7（0.912）、X8（0.794）的载荷较大。v1代表了茄衣烟叶的颜色参数变化情况，由v1与原始数据的相关系数可知，Y1（0.971）的载荷较大。但由于X7的系数与相关系数互为反号，所以其在u1中是校正（或抑制）变量[13]，本文不予分析。因此，第1组典型变量可理解为，在一定范围内随着叶绿素a、类胡萝卜素含量的降低以及总氮的升高，明度值 L*呈降低趋势。

得第2组典型变量为：

u2=-1.478X1+1.035X2-0.861X3+0.371X4-0.969X5+1.401X6-1.1X7+0.29X8；

v2=-0.247Y1+1.02Y2+38.507Y3-37.501Y4+28.936Y5+18.478Y6。

从第2组典型变量可以看出，除去校正（抑制）变量后，化学成分与质体色素含量中X1（-0.53）、X7（-0.316）的载荷较大，颜色参数中Y4（-0.546）、Y6（0.53）载荷较大。因此，第2组典型变量可理解为，在一定范围内随着总糖和叶绿素b含量的降低，引起饱和度C的降低和色相角H°的升高。

3 讨论

茄衣是一支成品雪茄质量的直观体现。优质马杜罗茄衣一般由深度发酵法生产，发酵后的茄衣色泽更深，有利于提高烟叶可用性[14]。有研究表明，采用CIE色度系统可以对烟叶颜色进行量化，发酵期间烟叶颜色的变化可以通过色差参数反映[15-16]。本研究也就发酵期间马杜罗茄衣烟叶颜色的变化进行了分析，发现不同厚度茄衣的明度值具有显著差异，这与王浩雅等人[17]的研究结果一致。前人研究结果显示明度值与烟碱含量、钾含量分别呈极显著负相关和极显著正相关[5]，而随烟叶厚度的增加，烟碱含量与钾含量分别有上升和下降的趋势[18-19]，从而分析明度值应当与烟叶厚度呈负相关关系，本研究结果也证明了这一点。茄衣烟叶发酵后期的红绿值与黄蓝值有所回升，这与烤烟相关研究结果不同[20-21]，究其原因可能是雪茄烟需要通过发酵这一步骤促进烟叶积累的营养物质分解转化，进而提高烟叶品质[22]，而在20～25 d烟叶发酵的程度已趋于完善，多酚、氨基酸等无色的香气前体物质因棕色化反应产生的棕褐色物质逐渐积累，引发了烟叶红度和黄度的升高[23]。

前人研究结果普遍认为有两方面的原因导致烟叶发酵过程中产生颜色变化。其一，烟叶的颜色变化是其内含物分解和转化等生理生化变化的外在反映[24-25]。在本试验中，随着发酵的进行，烟叶总糖含量逐渐降低，这是由于糖类被逐步氧化或参与了酚、醇类的反应生成香气物质；烟碱含量同样随着发酵的进行逐渐降低，主要是游离态的烟碱挥发所引起的[26]。与总糖不同，还原糖含量随着发酵的进行呈现单峰变化，这可能是发酵前期淀粉等多糖降解速度较快，使还原糖含量暂时升高[27]。钾含量在发酵过程中呈现先增后减的变化趋势，与前人[28-29]研究结果相吻合。这可能是由于烟叶中一些有机复合物的形成有金属元素参与，随着适宜条件下有机复合物的挥发，金属元素的绝对含量有所降低[30]。总氮含量与氯含量呈现波动上升的变化情况，可能是由于碳水化合物、有机酸等物质放出CO2及其他物质的逸失，导致干物质总量降低，总氮、氯含量相对上升[20]。总体而言厚茄衣的变化幅度较低，这与莫娇等人[31]研究结果一致，可能是由于厚茄衣内含物质丰富，降解速率较慢。其二，质体色素含量的变化是烟叶颜色的主要影响因素之一，并且是重要的香气前体物质[32]。随着发酵的进行，烟叶各类质体色素含量均呈现逐步降低的变化趋势，与张晓娟[33]、赵奕熹[34]等人研究结果一致，这是由于发酵期间烟叶内生理生化反应仍在进行，质体色素被分解为新植二烯、β-大马酮、紫罗兰酮等香气物质。上述两方面的结果表明，化学成分、质体色素的变化与颜色参数变化相似，即虽然不同厚度茄衣中上述物质的含量有差异，但其总体变化情况较为一致。这说明尽管茄衣厚薄并不影响发酵过程中烟叶内含物分解转化的方向，但生产中仍应考虑茄衣厚度不同造成的发酵程度差异。

烟叶各类性状指标间虽然存在关联性，但密切程度不同，因此利用典型相关分析的方法寻找影响烟叶颜色的主要化学成分[35]。典型相关分析中第1组典型变量表明，在一定范围内；随着叶绿素a、类胡萝卜素含量的降低以及总氮含量的升高，明度值 L*呈降低趋势，这主要是因为总氮含量可以反映烟叶内含物质的量，通常来说，具有丰富内含物质的烟叶颜色较深[36]，而叶绿素a、类胡萝卜素作为有色物质其含量直接影响烟叶颜色的深浅[37]；第2组典型变量表明，饱和度C和色相角H°受化学成分中的总糖和叶绿素b含量影响较大，由典型载荷可以得出，在一定范围内：随着总糖和叶绿素b含量的降低，引起饱和度C的降低和色相角H°的升高。由典型相关分析结果可以看出，烟叶颜色与化学成分间具有密切的联系，可以通过调控烟叶化学成分来影响茄衣的外在颜色。

目前，国产马杜罗茄衣较为少见，本试验通过研究马杜罗茄衣在深度发酵过程中的外观颜色和内在成分的变化及关系，为工业企业的实际应用提供理论参考。由于本试验仅局限于“海南3号”品种烟叶，如何针对不同素质烟叶调控发酵工艺以改善烟叶内含物质、进而达到改善马杜罗茄衣工业使用目的，将是今后的研究重点。

4 结论

随着发酵的进行，茄衣烟叶颜色参数值（L*、a*、b*、C*）均呈下降趋势，不同厚度茄衣间明度值差异显著。随着发酵时间增加，茄衣中总糖、烟碱和质体色素含量逐渐降低；还原糖与钾含量呈单峰变化；总氮与氯含量波动上升。除氯含量外，烟叶各项化学成分均与多项颜色参数间存在密切的关系。通过适宜的发酵可以达到改善茄衣烟叶颜色的目的。