活动期肺结核患者血浆miR-29家族及血清、外周血单个核细胞中γ干扰素的表达及意义
2021-11-22张国栋丁雷朱英斌吴海良
张国栋,丁雷,朱英斌,吴海良
肺结核是一种由结核分枝杆菌引起的慢性呼吸道传染病,肺结核严重威胁患者健康,目前仍是导致人类死亡的十大原因之一[1]。2019年全球范围内估计有1 000万人罹患结核病[2],我国结核病数量占全球第三,每年新增病例100万例。目前肺结核的诊断以病原学和病理学为基础结合临床辅助诊断技术进行综合判断[3]。病原学分析培养周期长,可长达2~8周,电子支气管镜检测假阴性较高,临床上痰涂片法敏感度较低[4]。因此,开发肺结核检测新型指标具有重要意义。肺结核感染分为潜伏期肺结核和活动期肺结核,潜伏期肺结核患者无临床症状,但是病原菌检测为阳性,当机体免疫力下降时,可逐步发展为活动期肺结核[5]。miRNA为一类短序列非编码的小RNA,参与调控干细胞分化、胚胎造血、细胞增殖等生物学过程[6]。目前已有研究显示,miRNA与肺结核的活动性相关[7]。本研究比较了miR-29家族在不同人群中的表达差异,分析了miR-29a和靶基因γ干扰素(IFN-γ)与活动期肺结核临床症状的关系,报道如下。
1 资料和方法
1.1 一般资料 选取2018年1月—2020年1月济南市人民医院、山东省胸科医院收治的肺结核患者104例,男53例,女51例,年龄30~75(42.31±16.72)岁。患者按有无临床症状分为活动性肺结核组和潜伏结核感染组,活动性肺结核组患者52例,男26例,女26例,年龄(38.72±16.13)岁;潜伏结核感染组患者52例,男27例,女25例,年龄(43.21±17.24)岁。另选同期医院体检健康者45例作为健康对照组,男23例,女22例,年龄(40.31±20.22)岁。3组受试者性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准(批准文号:2018JN-16),入选者及家属均知情同意并签署知情同意书。
1.2 病例选择标准 活动期肺结核诊断标准符合《中华人民共和国卫生行业标准(WS288-2008) 肺结核诊断标准》[8]。潜伏期肺结核诊断标准:无临床症状,胸部X线正常,γ-干扰素或结核菌素阳性。纳入标准:(1)单一肺结核感染;(2)年龄20~70岁;(3)肺结核初治;(4)肝肾功能正常。排除标准:(1)合并肝炎或HIV感染;(2)合并肾炎;(3)免疫性疾病;(4)合并恶性肿瘤。
1.3 观察指标与方法 (1)收集受试者临床资料,包括性别、年龄、白细胞计数(WBC)、红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)、淋巴细胞计数、单核细胞计数、临床症状等资料。(2)检测血清IFN-γ蛋白:取受试者清晨静脉血,3 000 r/min、4℃离心10 min,取上层血清应用ELISA法测定血清IFN-γ。(3)单个核细胞IFN-γ mRNA和血浆miR-29a、miR-29b和miR-29c表达检测:采集受试者清晨空腹肘静脉血3 ml于EDTA抗凝管中,4 h内以相对离心力2 000 g 离心20 min,弃上清,用淋巴细胞分离液按常规操作提取单个核细胞储存于-80℃冰箱备检,并将外周血分离血浆。血浆和单个核细胞提取mRNA,TRIzol裂解细胞,酚氯仿抽提总RNA,分光光度计测定RNA质量,琼脂糖凝胶电泳检测其完整性,反转录为cDNA。反转录体系:RNA 1 μg,PolyA聚合酶2 μl,RTase Mix 2 μl,5×缓冲液10 μl,ddH2O至50 μl。37℃ 60 min,85℃ 5 min灭活。所得cDNA进行RT-PCR,反应体系:2×SYBR Green qPCR Mix 10 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、cDNA 1 μl、ddH2O 7 μl。RT-PCR程序:95℃预变性30 s,95℃ 10 s,58℃退火延伸30 s, 35个循环。以U6作为内参基因,各引物序列见表1,以2-ΔΔCt法计算各样本中基因的表达量。
表1 研究采用引物序列
2 结 果
2.1 3组受试者血液学相关指标比较 3组受试者WBC、单核细胞比较,差异无统计学意义(P>0.05)。ESR、CRP、淋巴细胞数比较,活动性肺结核组>潜伏结核感染组>健康对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05),见表2。
表2 3组受试者血液学相关指标比较
2.2 3组受试者血浆miR-29a、miR-29b和miR-29c比较 血浆miR-29a表达比较,活动性肺结核组>潜伏结核感染组>健康对照组(P<0.05);3组血浆miR-29b和miR-29c比较差异无统计学意义(P>0.05),见表3。
表3 3组受试者血浆miR-29a、miR-29b和miR-29c比较
2.3 3组受试者单个核细胞IFN-γ mRNA和血清IFN-γ比较 单个核细胞IFN-γ mRNA和血清IFN-γ水平比较,活动性肺结核组<潜伏结核感染组<健康对照组,差异具有统计学意义(P<0.01),见表4。
表4 3组受试者单个核细胞IFN-γ mRNA和血清IFN-γ比较
2.4 血清IFN-γ、血浆miR-29a水平与活动性肺结核临床症状的关系 活动性肺结核组患者依据是否有咳嗽、 胸痛、呼吸困难进行分组,组间血清IFN-γ、血浆miR-29a水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。活动性肺结核组内有发热、咯血症状患者的血清IFN-γ水平低于无发热、咯血症状的患者;有发热、咯血症状患者血浆miR-29a水平高于无发热、咯血症状的患者(P<0.01),见表5。
表5 血清IFN-γ、血浆miR-29a与活动性肺结核临床症状的关系
2.5 血清IFN-γ、血浆miR-29a水平对活动性肺结核的临床诊断价值 ROC曲线显示,血清IFN-γ、miR-29a诊断活动性肺结核的临界值为257.31 pg/ml、1.13, 曲线下面积(AUC)为0.614、0.753,敏感度为0.573、0.682,特异度为0.801、0.802;二者联合诊断活动性肺结核的AUC为0.784,敏感度为0.710,特异度为0.850,见表6、图1。
表6 血清IFN-γ和血浆miR-29a对活动性肺结核的临床诊断价值
图1 血清IFN-γ、血浆miR-29a及二者联合诊断活动性肺结核的ROC曲线
3 讨 论
我国是肺结核高发国家之一,给居民健康和社会发展带来巨大危害。目前肺结核诊断仍然缺乏特异度高且快速的检测方法,寻找快速准确的临床检测指标具有重要意义。miRNA是一种源自内源性染色体的非编码单链RNA,miRNA参与机体的诸多生理功能,如细菌感染、细胞凋亡、胚胎发育等过程[9-10]。miRNA具有检测简单、样品保存时间长等优点,是一种潜在的肺结核检测指标。
目前研究显示,已有多个miRNA与肺结核的发生、发展存在关联。树突状细胞被结核分枝杆菌感染后,miRNA-155可下调ATG3水平,从而引发细胞的自噬[11]。miRNA-144与活动性肺结核相关,可通过下调TNF-α和IFN-γ的水平抑制机体保护性免疫过程,影响肺结核的发生、发展[12]。体内和体外研究中均证实miR-let-7与肺结核相关,结核分枝杆菌感染后巨噬细胞miR-let-7的表达下调,降低NF-κB通路的活性[13]。
此外,miR-21、miR-223等miRNA也被认为与肺结核的发生发展有关[14]。
miR-29家族主要分为miR-29a、miR-29b和miR-29c。目前的研究显示,miR-29家族参与抑制细胞外基质蛋白的合成,与肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化、心肌纤维化均存在关联[15-16]。miR-29家族通过下调抗凋亡蛋白水平、诱导胰岛β细胞凋亡,参与1型糖尿病的发生[17]。miR-29家族还参与了肿瘤的发生、发展,在不同的肿瘤中分别起抑癌作用和促癌作用[18]。
目前有研究表明,miR-29家族可通过调控T细胞分化,发挥机体抗感染免疫反应作用[19],而在结核病发病过程中,其在T细胞介导的细胞免疫中发挥了重要作用,因此本研究比较了健康对照组、活动性肺结核组和潜伏结核感染组患者miR-29a、miR-29b和miR-29c差异,结果显示,活动性肺结核组miR-29a表达上调,而miR-29b和miR-29c表达未出现十分明显的数据变化。该结果提示,在人体感染结核分枝杆菌之后,miR-29a有可能负向调控人体对于病原体的免疫应答情况,抑制机体对病原体抵抗能力,导致结核分枝杆菌的活动性增高。同时miR-29a可能通过调控p85等蛋白的表达,使p53激活,从而诱导细胞凋亡,促使肺结核的病情加重。本研究结果中miR-29b和miR-29c在3组受试者中未见明显的变化,推测这可能与受试者人群数量较少有关,同时miR-29b和miR-29c在肺结核中的作用尚不明确,这也成为今后研究的一个方向。
目前的主流研究认为,miR-29a能通过调节靶基因IFN-γ的表达而降低机体对胞内病原体的免疫应答水平[20]。本研究结果显示,活动性肺结核患者单个核细胞IFN-γ mRNA和血清IFN-γ水平显著下降,因此可以推测miR-29a主要参与了肺结核的发展。结核分枝杆菌感染机体后,导致miR-29a水平上调,miR-29a可促进IFN-γ mRNA与Ago2形成沉默复合物,抑制IFN-γ的表达,从而降低机体对结核分枝杆菌的免疫应答[21]。IFN-γ是抗结核感染免疫反应中的关键细胞因子,miR-29 可通过上调靶向作用于细胞凋亡相关蛋白参与调节免疫细胞凋亡通路及促进IFN-γ mRNA 降解,降低IFN-γ的产生和促进针对结核分枝杆菌的免疫细胞凋亡,从而使其得以逃避宿主免疫应答。
此外本研究还初步分析了IFN-γ mRNA和miR-29a水平与肺结核患者多项典型临床症状之间的关系,结果表明,IFN-γ mRNA和miR-29a水平与肺结核病变程度之间具有一定的相关性。为了进一步评估IFN-γ和miR-29a在活动性肺结核中的临床价值,构建了ROC曲线,确定了IFN-γ和miR-29a在活动性肺结核中的临界值,表明临床可通过检测IFN-γ和miR-29a水平用于活动性肺结核的诊断。然而,仅依靠IFN-γ mRNA和miR-29a水平对活动性肺结核进行诊断具有很大的误差可能,因此在实际工作中,推荐利用多种指标进行综合推断。而本研究中所关注的这2个指标,也同时需要进行更加深入的分析,以期待具有更为客观及实用的结果出现。
综上所述,miR-29a可通过调节IFN-γ的表达参与结核病的发病,临床研究可进一步将miR-29a发展为结核病的检测、评价指标。本研究中miR-29b和miR-29c的作用不明,有待进一步研究。
利益冲突:所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明
张国栋:设计研究方案,实施研究过程,起草论文;丁雷:数据收集,分析整理;朱英斌:进行文献调研与整理,修改论文;吴海良:提出研究方向,研究选题,论文终审