白藜芦醇通过调控NLRP3/caspase-1信号通路抑制H2O2诱导的心肌纤维化*

赵雅欣，范奕好，程 阳，蒙中元，吴建福，吴倩文，何 燕

(广西医科大学第一附属医院，南宁 530000)

心房颤动(房颤)是最常见的心律失常，房颤的药物治疗效果较差，其中一个关键原因是心肌纤维化过程难以逆转。心脏重构与氧化应激水平升高、细胞凋亡均与心肌纤维化有关，心房纤维化引起的结构重构促进了房颤的发生和发展[1-5]。衰老和高血压均可诱发心房纤维化[6]。有研究表明，高血压患者存在固有免疫异常激活，介导下游炎性反应的发生[7]。炎症所致的结构重构是发生房颤的重要病理生理基础[8]。预防心房纤维化可能是治疗房颤的关键靶点之一[9]。

白藜芦醇(resveratrol，RES)是一种具有较强的抗氧化和抗炎活性的天然多酚化合物，其存在于葡萄、花生等植物中[10]。有研究表明，RES可参与干扰成纤维细胞活化过程而发挥对心肌肥厚、心肌纤维化和心力衰竭的治疗作用[11-12]。然而，其具体作用机制尚未清楚。因此，本研究探讨了RES是否通过抑制氧化应激下的炎性反应从而抑制心肌纤维化，以期进一步明确RES对心肌纤维化的干预作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SD乳鼠(出生1～3 d)10只均购自广西医科大学实验动物中心。

1.2 试剂

RES、过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)均购自美国Sigma公司，兔抗大鼠NOD样受体蛋白3(NOD like receptor protein 3，NLRP3)抗体购自美国Abcam公司，兔抗大鼠Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)/Ⅲ型胶原(Ⅲ型胶原)抗体、兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗均购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.3 仪器

提RNA试剂盒、cDNA逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司，NanoDrop微量核酸蛋白分析仪购自美国Thermo Fisher公司，7500实时荧光定量PCR仪购自美国Thermo Fisher公司，FluorChem FC3全能型成像系统购自美国ProteiinSimple公司。

1.4 方法

1.4.1细胞培养

取SD乳鼠心脏，使用差速贴壁法提取心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs)于10%胎牛血清进行培养。采用倒置相差显微镜观察SD乳鼠CFs形态。

1.4.2免疫荧光鉴定

取2代细胞进行细胞爬片后去掉培养基，磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution，PBS)洗5 min×2，4%多聚甲醛室温固定细胞15 min，用PBS洗5 min×3，0.25%Triton破膜，37 ℃保存10 min，用PBS洗5 min×3，10%山羊血清溶液37 ℃封闭30 min，一抗4 ℃孵育过夜。第2天取爬片，用PBS洗10 min×3，荧光标记素标记羊抗兔二抗37 ℃孵育45 min，用PBS洗10 min×3，抗荧光埣灭剂(含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)封片，于荧光共聚焦显微镜下拍照观察。

1.4.3CCK-8法检测CFs存活率

细胞培养后分为对照组，H2O2(5、10、20、40、80 μmol/L)组，接种于96孔板培养24 h后将培养基更换成含不同浓度H2O2的培养基预处理6 h后更换培养基，再加入CCK-8试剂10 μL，37 ℃孵育3 h，在450 nm波长处使用酶标仪检测其光密度值，计算CFs存活率。

1.4.4PCR检测基因表达水平

将细胞分为对照组、H2O2(10 μmol/L)组和H2O2(10 μmol/L)+RES(5 μmol/L)组，RES预处理12 h后加H2O2(10 μmol/L)处理6 h，提取RNA，逆转录，加GAPDH、白细胞介素(interleukin，IL-1)、caspase-1、CollagenⅠ、CollagenⅢ引物上机并计算相关基因表达量。

1.4.5Western blot检测蛋白表达水平

分组处理与1.4.4项相同，提取蛋白并用2,2′-联喹啉-4,4′-二羧酸二钠检测蛋白浓度，对蛋白样品(总量30 μg/μL)进行电泳，转膜，GAPDH、NLRP3、caspase-1、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白抗体孵育，二抗孵育，增强化学发光法显色，计算上述蛋白表达水平。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 倒置相差显微镜观察SD乳鼠CFs形态

细胞逐渐变成为成纤维细胞形态，体积大，呈三角形或星形，一般含2～3个细胞核，核较大且多居中，细胞核呈卵圆形，细胞质透明。细胞呈放射状贴壁，随着细胞融合度增加逐渐变为梭形，见图1。

图1 倒置相差显微镜观察CFs形态(40×)

2.2 免疫荧光鉴定

CFs特异性生物学标记物——波形蛋白呈阳性表达，说明培养的细胞为CFs，见图1、2。

2.3 CCK-8法检测CFs存活率

与对照组比较，H2O2(10 μmol/L)组CFs存活率明显降低，差异有统计学意义(P<0.05),见图3；与H2O2(10 μmol/L)组比较，H2O2(10 μmol/L)+RES(5 μmol/L)组CFs存活率明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

图2 CFs表达波形蛋白的免疫荧光鉴定(100×)

a:P<0.05，与对照组比较。

a:P<0.05，与对照组比较;b:P<0.05，与H2O2(10 μmol/L)组比较。

2.4 PCR检测基因表达水平

与对照组比较，H2O2(10 μmol/L)组IL-1、caspase-1、CollagenⅠ、CollagenⅢ基因表达水平均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与H2O2(10 μmol/L)组比较，H2O2(10 μmol/L)+RES(5 μmol/L)组IL-1、caspase-1、CollagenⅠ、CollagenⅢ基因表达水平均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图5。

2.5 Western blot检测蛋白表达水平

与对照组比较，H2O2(10 μmol/L)组和H2O2(10 μmol/L)+RES(5 μmol/L)组NLRP3、caspase-1、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表达均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与H2O2(10 μmol/L)组比较，H2O2(10 μmol/L)+RES(5 μmol/L)组NLRP3、caspase-1、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表达均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图6。

A：对照组；B：H2O2(10 μmol/L)组；C：H2O2(10 μmol/L)+RES(5 μmol/L)组。a:P<0.05，与对照组比较;b:P<0.05，与H2O2(10 μmol/L)组比较。

A：对照组；B：H2O2(10 μmol/L)组；C：H2O2(10 μmol/L)+RES(5 μmol/L)组。a:P<0.05，与对照组比较;b:P<0.05，与H2O2(10 μmol/L)组比较。

3 讨 论

目前，有研究表明，心房重构、自主神经系统改变、钙离子异常电流共同作用引起房颤，其中心房重构在房颤中扮演了重要角色[13]。心房重构由心房结构重构和心房电重构组成，心肌纤维化是结构重构的特征性改变，其主要表现为胶原沉积导致的细胞外基质扩增，CollagenⅠ/CollagenⅢ比例的改变造成细胞外基质代谢异常，进而导致正常心肌纤维网络结构被破坏，从而影响心肌细胞之间的传导连续性，包括减慢传导速度、增加传导异质性等，为折返环的形成和单项传导阻滞提供了病理基础[14-15]。心肌纤维化作为房颤最危险的因素之一，探讨其发病机制对阻断心房结构重构具有重要意义，可为房颤的预防和治疗提供新的思路。

NLRP3炎症小体是机体固有免疫的重要组成部分，其通过促发宿主细胞的炎性反应而达到消灭入侵细菌的目的[16]。NLRP3被细胞内外相关信号激活后可通过调控下游关键效应分子(如caspase-1)引发炎症级联反应，最终导致局部或全身炎性反应。有研究在小鼠压力超负荷模型中发现，NLRP3炎症小体参与了心室重构的病理生理过程，NLRP3被抑制时心室重构可获得改善[17]。在瓣膜性房颤患者中心房NLRP3表达明显增高，并在心房炎性反应和血栓形成中发挥着重要作用[18]。 本研究结果显示，CFs被H2O2刺激后NLRP3、caspase-1、IL-1、CollagenⅠ、CollagenⅢ均升高，说明CFs在氧化应激下可能促进了炎性反应，进而促进了CFs纤维化。

RES是主要存在于桑葚、葡萄、花生等植物内的多酚类化合物，据文献报道，其具有广泛的生物和药理活性，对各大系统如心血管、呼吸、神经等发挥抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗凋亡等作用[19-22]。本研究结果显示，当H2O2刺激CFs氧化应激产生炎性反应，加入RES后抑制NLRP3、caspase-1蛋白表达，并降低CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表达，从而减轻心肌纤维化。

综上所述，RES可能通过NLRP3/caspase-1信号通路调节氧化应激水平抑制炎性反应，进而减轻心肌纤维化，为预防和治疗房颤提供了新靶点。