胚胎体外培养对小鼠8细胞期胚胎发育潜能的影响及DNA损伤研究*

马 媛，杨 洋，陈书强，王晓红

(1.中国人民解放军空军军医大学唐都医院妇产科生殖医学中心，西安 710038;2.西安市第四医院生殖医学中心，西安 710004)

辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)是指以治疗不孕不育症为目的而采取的一切在体外操作配子及胚胎的治疗手段或方法，主要包括体外受精、胚胎体外培养、胚胎冷冻解冻技术等。但是，由于体外环境和体内的生理环境具有极大的不同，目前体外条件仍无法完全模拟体内环境。与此同时，胚胎早期其本身尚不具备屏障和保护功能。因此，体外培养环境会给配子及胚胎造成环境应激，影响胚胎的发育潜能。本课题组前期研究发现[1]，胚胎体外培养可影响小鼠胚胎的发育，降低囊胚形成率及着床率，影响后期胎鼠的宫内生长。但是，胚胎发育及存活率下降的相关机制尚不明确。在生命活动进行时，维持基因组稳定性需要DNA精确的复制和遗传。DNA的完整性是保障胚胎发育、胚胎种植甚至子代健康的基础[2]。如果DNA遭受到内源性或外源性刺激，可引起DNA损伤，从而导致细胞凋亡、细胞周期阻滞及DNA损伤修复等。其中，DNA双链断裂(DNA double-strand break,DSB)[3]对基因组完整性及后续的细胞存活具有严重的影响。既往研究显示[4-6]，ART中多个步骤会导致DNA损伤，进一步影响配子的质量、胚胎发育甚至胎儿发育。本研究以DNA损伤为出发点，研究体外培养环境对小鼠胚胎DSBs的影响，为体外培养技术影响胚胎发育的潜在机制研究提供思路与方向。

1 资料与方法

1.1 实验材料 清洁级ICR小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。雌鼠4～6周龄，雄鼠3～6月龄。主要试剂和仪器：胚胎培养采用KSOM(Millipore,美国)，微量胚胎cDNA线性扩增使用德国Qiagen的试剂盒REPLI-g WTA single Cell Kit,荧光聚合酶链反应试剂盒均购自Takara公司(日本)，一抗γH2AX抗体购自英国Abcam公司(兔单克隆抗体，Anti-gamma H2AX，ab81299)，二抗购自美国invitrogen公司(驴抗兔，A21206)，Hoechst购自美国Sigma公司(Hoechst 33258 solution)。实体解剖镜(Motic,中国)，CO2培养箱(Thermo,美国)，培养皿(35mm)(Nunc,丹麦)，超净台(Labconco,美国)，荧光定量PCR仪(Bio-Rad，美国),激光共聚焦显微镜(Olympus,日本)。

1.2 研究方法

1.2.1 小鼠模型建立及胚胎收集 自然交配组(natural conception，NC)组:选取发情雌鼠，与雄鼠自然合笼，次日检查阴栓。见栓即为交配成功，当日计为0.5天。于2.5天处死孕鼠取双侧输卵管，PBS冲洗获得8细胞期胚胎。体外培养组(in vitro culture，IVC)组：选取发情雌鼠，与雄鼠自然合笼，次日检查阴栓。见栓当日处死雌鼠，于输卵管取受精卵，用0.3%透明质酸酶消化受精卵周围颗粒细胞，将消化分离的受精卵多次冲洗，转入KSOM溶液中培养，于培养的2.5天收集8细胞期胚胎。

1.2.2 实时定量PCR检测 (1)微量胚胎cDNA线性扩增：使用德国Qiagen的试剂盒REPLI-g WTA single Cell Kit，选择每组8细胞期胚胎20枚，严格按说明书进行。(2)实时定量PCR检测：根据TaKaRa实时定量PCR试剂盒说明配制反应体系，反应总体系为20μl:SYBR Green 10μl，PCR特异上、下游引物按1：1混合后取1.5μl,cDNA模板1.5μl,灭菌蒸馏水7μl。扩增条件：95℃ 3min;95℃ 15s,60℃ 30s,72℃ 30s,35个cycle;72℃ 2min。以GAPDH为内参，进行PCR反应，引物序列来自Primerbank。每次检测设定3个复孔，每个样本重复3次。以上在每个PCR循环的延伸期采集荧光信号，PCR反应完成后利用温度梯度变性获得溶解曲线供PCR产物定性分析。根据PCR扩增曲线，得到每个样本的循环周期数(Cq值)，2-△△Ct法计算各组目的基因表达。胚胎发育潜能相关基因引物序列及DNA损伤相关因子引物序列，见表1、2。

表1 胚胎发育潜能相关基因引物序列

表2 DNA损伤相关因子引物序列

1.2.3 胚胎免疫荧光检测及分析 (1)胚胎免疫荧光操作。收集两组8细胞期胚胎，以下每个操作步骤之间均需用含0.1%PVA的PBS洗涤8细胞期胚胎3次。4%多聚甲醛室温固定2h，转入0.2%Triton-X打孔30min,封闭液室温封闭2h，转入一抗4℃孵育过夜，γH2AX一抗为兔源，浓度为1：2000。次日，两组8细胞期胚胎转入488标记的抗兔荧光二抗，二抗浓度1：500，避光孵育2h。用含10μg/mL Hoechst的PBS室温避光染核30min，PBS洗涤干净，封片，荧光显微镜照相。(2)胚胎免疫荧光分析。荧光亮度采用软件Image J进行分析，选取目标区域，分析该区域平均光密度水平，同样计算出同一样本Hoechst染核的平均光密度。γH2AX平均光密度值与核平均光密度值比值即为本样品的实际平均光密度值。

2 结 果

2.1 胚胎体外培养对8细胞期胚胎早期发育的影响 与NC组相比，IVC组的Lif表达明显下调，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 两组8细胞期胚胎发育潜能比较

2.2 体外培养对8细胞期胚胎DNA损伤的影响研究 与NC组相比，IVC组γH2AX相对荧光密度显著升高，差异有统计学意义(0.537±0.133 vs 0.419±0.095,P<0.05),见图1。

2.3 体外培养对胚胎DNA损伤相关基因表达的影响研究 与NC组相比，IVC组的DNA损伤相关基因Casp3(NC 0.985±0.033 vs IVC 1.641±0.319)和Fas(NC 0.897±0.121 vs IVC 0.994±0.147)表达显著上升，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 体外培养对8细胞期胚胎DNA损伤相关基因表达的影响

图1 体外培养对8细胞期胚胎γH2AX的影响

3 讨 论

在胚胎早期，一些影响胚胎早期分化及发育的标志性分子的改变，可导致胚胎发育异常，决定胚胎的命运。研究发现，体外培养环境可影响小鼠胚胎的多个命运决定因子。这些因子中，Pou5f1、Nanog是多潜能因子，可促进小鼠胚胎中细胞的多项分化功能[7]。而Lif可支持卵裂期细胞向囊胚发育，并促进胚胎着床能力[8]。本研究发现，IVC组的Lif表达明显下调。既往研究表明，体外培养的山羊及猫的胚胎也出现了早期胚胎命运决定相关因子的变化[9-10]，与本研究结果一致。提示单纯体外培养环境即可影响小鼠胚胎的早期命运。

DNA的精确复制和遗传对维持基因组稳定性有重要作用。如早期胚胎在DNA复制和遗传过程中发生损伤，可能影响胚胎及子代发育。既往有研究提示，ART技术可导致DNA损伤[2,4,6]。与辅助生殖技术相关的DNA损伤是影响配子和胚胎发育的重要因素[11]。体外培养技术是ART中重要的组成部分，故本研究进一步对经体外培养的小鼠胚胎DNA损伤及相关损伤修复因子的表达进行分析。

H2AX是哺乳动物细胞中核心组蛋白H2A的亚型，当发生DSBs时，H2AX蛋白发生磷酸化形成γ-H2AX，因此，对γ-H2AX的识别成为检测DSBs的理想手段[3]。本研究显示，IVC组γH2AX相对荧光密度显著升高。提示体外培养可导致胚胎中DNA双链断裂损伤的发生增加。

在DSBs过程中，一些因子可在细胞凋亡、染色质重排、DNA修复等过程发挥作用。Gadd45a参与细胞周期调控、DNA损伤修复、细胞凋亡及信号转导等过程[12]。Fas系统是死亡受体信号转导途径的重要凋亡途径之一，Casp3是Fas介导细胞凋亡信号传导通路中的核心蛋白，是细胞凋亡性死亡的最终执行者[13]。Ddit3参与内质网应激参与的凋亡通路[14]。本研究发现，与NC组相比，IVC组的DNA损伤相关基因Fas和Casp3表达显著上升。提示体外培养环境可在导致DNA双链断裂损伤，并在多个方面发挥作用，可能诱导细胞凋亡和染色质重排，影响小鼠早期胚胎的发育。

关于ART技术导致DNA损伤影响的研究中发现，体外受精-胚胎移植的小鼠胎儿脑组织中DNA损伤修复基因表达显著改变[6]，玻璃化冷冻技术可导致小鼠卵母细胞DNA损伤加剧[4]。以上研究包括本项研究均提示ART技术与DNA损伤具有密切关系，关于其对后续胎鼠发育的影响仍需进一步研究。

综上所述，体外培养可导致小鼠8细胞期胚胎多潜能因子(Lif等)表达水平明显下调，可能与小鼠胚胎DNA损伤相关基因(Casp3、Fas等)表达水平明显上调相关，将影响小鼠胚胎发育潜能。