复发性流产孕妇血清及胚胎组织中Klotho蛋白表达水平的分析

崔 进，张秀娟，祝 倩

（潍坊市妇幼保健院，山东 潍坊 261000）

据调查，在发生自然流产的孕妇中，复发性流产孕妇占1% ～5%[1-2]。研究发现，复发性流产的发生与孕妇的染色体异常、子宫结构及功能异常、发生感染、内分泌功能紊乱、存在自身免疫系统疾病等因素有关[3-5]。Klotho 蛋白是1997 年发现的一种抗衰老蛋白[6]。Klotho蛋白可参与到心血管疾病、肾脏损伤、肿瘤、代谢病等多种疾病的发生、发展中[7]。近年来的研究结果显示，Klotho 蛋白在子痫前期、子宫内膜异位症、早产等妇产科疾病患者体内呈异常表达。有研究者认为，Klotho 蛋白可能通过与其受体结合影响相关信号的传导通路[8]，引发基因突变、胚胎发育异常，进而导致孕妇发生流产。本次研究主要是分析复发性流产孕妇血清及胚胎组织中Klotho 蛋白表达的水平。

本次研究的对象是2019 年3 月至10 月期间在潍坊市妇幼保健院进行人工流产手术的80 例复发性流产孕妇及同期该院收治的100 例胚胎正常要求流产的孕妇。将其中80 例复发性流产孕妇设为复发性流产组，将其中100 例胚胎正常主动要求流产的孕妇设为正常妊娠要求流产组。复发性流产组孕妇的平均年龄为（28.5±1.3）岁，其流产时的平均孕周为（7.8±0.3）周。本组孕妇进行腹部超声检查的结果显示其胚胎停止发育或孕7 周后多次腹部超声检查的结果提示其宫腔内无胎芽及胎心搏动。胚胎正常要求流产组孕妇的平均年龄为（26.5±1.8）岁，其流产时的平均孕周为（7.8±0.2）周。本组孕妇进行腹部超声检查可见其宫腔内存在胚芽及胎心搏动。两组孕妇的一般资料相比，P＞0.05，具有可比性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.2 纳入及排除标准

本次研究对象的纳入标准是：1）既往身体健康，无内、外科疾病史；2）自然受孕；3）在此次妊娠的前3个月月经正常。本次研究对象的排除标准是：1）存在妊娠期并发症；2）在妊娠期间接受过药物治疗。

1.3 标本采集方法

在对两组孕妇进行人工流产手术前，均抽取其4 mL的空腹静脉血。对抽取的血液样本进行抗凝处理，然后放到离心机中进行10 min 的离心处理，离心机的转速为3000 r/min。将分离出的血清样本放到-80℃的冰箱中保存。在对两组孕妇进行人工流产手术后的10 min 内，取大小约0.8 cm×0.8 cm 的胚胎组织。使用生理盐水对胚胎组织进行3 次漂洗，将其分成两份。将其中一份胚胎组织置入灭活RNA 酶冻存液中，并放到-80℃的冰箱中保存。将另一份胚胎组织使用10%甲醛固定液进行固定，然后进行石蜡包埋处理，制作成组织切片，放到60℃的烤箱中烘干，然后置于37℃的温箱中保存。

1.4 检测方法

采用酶联免疫吸附法检测两组孕妇血清中Klotho 蛋白的表达水平，采用免疫组织化学法检测两组孕妇胚胎组织中Klotho 蛋白的表达水平。严格按照检测试剂盒的说明书进行操作。对切片组织进行高温高压抗原修复及DBA 显色处理。将PBS 液代替一抗作为阴性对照品，将已知阳性的胚胎组织作为阳性对照品。Klotho 在细胞膜与细胞质中均有表达，镜下表现为棕黄色颗粒。选取5个高倍镜视野，将阳性细胞占正常细胞的百分比作为评估进行Klotho 蛋白检测结果的标准。阳性细胞占正常细胞的百分比＜5%，计0 分。阳性细胞占正常细胞的百分比为5% ～20%，计1 分。阳性细胞占正常细胞的百分比为21%～50%，计2 分。阳性细胞占正常细胞的百分比＞50%，计3 分。若进行Klotho 蛋白检测结果的评分为0 分、1 分，表示检测结果为阴性。若进行Klotho蛋白检测结果的评分为2 分、3 分，表示检测结果为阳性。在免疫组织化学图像分析仪上计算阳性细胞数和灰度值，由凝胶图像分析处理系统完成图像采集、定性和半定量检测。

1.5 统计学方法

采用SPSS16.0 统计软件处理本次研究中的所有数据。计量资料用±s表示，用t检验。计数资料用%表示，采用χ² 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组孕妇血清Klotho 蛋白表达水平的比较

复发性流产组孕妇血清Klotho 蛋白的表达水平高于正常妊娠要求流产组孕妇，P＜0.05。详见表1。

表1 两组孕妇血清Klotho 蛋白表达水平的比较（ng/dl，± s）

表1 两组孕妇血清Klotho 蛋白表达水平的比较（ng/dl，± s）

注：a 表示与正常妊娠要求流产组相比，P ＜0.05。

组别 Klotho 蛋白复发性流产组（n=80） 1.25±0.38 a正常妊娠要求流产组（n=100） 1.09±0.26 t 值 3.2410 P 值 0.0016

2.2 两组孕妇胚胎组织中Klotho 蛋白表达水平的比较

复发性流产组孕妇胚胎组织中Klotho 蛋白的表达水平高于正常妊娠要求流产组孕妇，P＜0.05。详见表2。

表2 两组孕妇胚胎组织中Klotho 蛋白表达水平的比较（ng/dl，± s）

表2 两组孕妇胚胎组织中Klotho 蛋白表达水平的比较（ng/dl，± s）

注：a 表示与正常妊娠要求流产组相比，P ＜0.05。

组别 Klotho 蛋白复发性流产组（n=80） 2.05±0.34a正常妊娠要求流产组（n=100） 1.66±0.35 t 值 7.4868 P 值 0.0013

3 讨论

复发性流产的发生与孕妇的染色体异常、生殖器官结构异常、内分泌功能紊乱、感染等因素均有关。据调查，约有40% 的复发性流产孕妇的病因不能明确，且此类孕妇再次妊娠时发生流产的几率高达70%～80%[9]。

1997 年，研究者发现了Klotho 蛋白。人体可以通过多种方式调控Klotho 蛋白的表达水平[10-11]。例如，成纤维生长因子-3 可提高Klotho 蛋白的表达水平[12-13]，肾素- 血管紧张素可以降低Klotho 蛋白的表达水平，从而发挥不同的生理作用。Klotho 蛋白的表达产物包括膜结合蛋白和分泌型蛋白。膜结合蛋白位于细胞膜及细胞质中，胞外区的蛋白序列与葡萄糖苷酶相似。分泌型蛋白存在于血液循环中，是一种肽类激素。这两种蛋白的高表达均可通过影响机体相关元素的代谢对血管产生明显的保护作用[14-15]。有报道指出，Klotho 蛋白亦参与到了肾病、不孕不育症、皮肤萎缩、骨质疏松症等多种疾病的发生、发展中。近年来，越来越多的研究发现，klotho蛋白可以调节胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）的信号通路，并可参与氧化应激反应的整个过程。这提示，Klotho 蛋白在基因突变、蛋白质空间构象异常的发生、发展过程中发挥重要的作用[16]。在本研究中，复发性流产组孕妇外周血及胚胎组织中Klotho蛋白的表达水平均高于正常妊娠要求流产组孕妇，原因是：复发性流产孕妇体内高表达的Klotho 蛋白与细胞膜上的Klotho 蛋白受体结合后，可改变细胞的信号传导通路，生成多种生物因子，并作用于母体的内皮组织，导致血管内皮细胞功能损伤及母体血管内皮组织因子被激活，影响细胞内外物质的转运，引起基因突变、衰老甚至细胞死亡，进而可导致胚胎停止发育、孕妇发生流产。

本次研究的结果证实，与胚胎正常主动要求流产的孕妇相比，复发性流产孕妇血清及胚胎组织中Klotho 蛋白的表达水平较高。