残缘璃眼蜱玻片标本硼砂卡红染色试验

陆 静，李琳洁，阿丽雅，高珍珍

（内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

蜱虫和蚊子都属于节肢动物，在分类学上蜱虫被列为蜱螨目下的蜱亚目，最后归属于蜱总科，蜱科又分为三个科，分别是纳蜱科、软蜱科和硬蜱科[1-2]。硬蜱类的蜱虫是最常见且对人和家畜危害性最大的一类[3-4]。 残缘璃眼蜱（Hyalomma detritum），硬蜱科璃眼蜱属的一种蜱虫，国内主要分布在黑龙江、吉林、辽宁和内蒙古等省、自治区[5-6]。现阶段最普遍的蜱种分类方式是运用显微镜和解剖镜对其进行形态学鉴定，找到蜱虫最具特征性部位与《中国经济昆虫志》比对，来确定被检蜱虫的种类。目前，参考资料里用于区分不同蜱虫具有特征性的部位包括假头基、须肢、生殖孔、肛沟、盾板、孔区、足基节和气门板等，然后根据其有无、形状的不同、大小、长短和位置等来进行判别[7-8]。本试验探索研究了残缘璃眼蜱玻片标本硼砂卡红染色方法，建立了一种快速、简单、方便，标本清晰度高、对比性强、状态易于识别的染色条件，为制作高质量的残缘璃眼蜱玻片标本提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所需残缘璃眼蜱虫体，取自内蒙古农业大学兽医学院寄生虫标本室保存的标本。

1.2 试剂和仪器

盖玻片、载玻片、量筒、染色缸、三角瓶、挑虫针、研钵、中性树胶、丁香油、硼砂、卡红、乙醇、福尔马林和氢氧化钠，其中试剂均为国产分析纯。

显微镜（蔡司远东有限公司，PRIMOSTAR）、水浴锅（金坛市鑫鑫实验仪器有限公司，HH-1）、恒温培养箱 （上海一恒科学仪器有限公司，DHP-9011）、天平（上海佑科仪器仪表有限公司，YP5002）。

1.3 试剂配制

硼砂卡红染色液配制：将硼砂研磨后，制备成4%的硼砂水溶液，取100 mL该溶液加入1g研磨充分的卡红，并在水浴锅中加热至卡红完全溶解后，再加入100 mL70%的乙醇，静置24 h后，将硼砂卡红染色液过滤后放入棕色瓶中备用。

1%酸酒精配制：将1 mL的盐酸溶于99 mL70%乙醇中。

巴氏液配制：将8 g Nacl溶于30 mL福尔马林中，加蒸馏水至1000 mL。

1.4 玻片标本制作方法

虫体前处理：将10%的NaOH水溶液煮沸数分钟。对于较大的虫体，需要用昆虫针在虫体上刺些小孔，以利于虫体内部组织的溶出，将虫体置于溶液中，加热直至虫体内部的肌肉和内脏被溶解排出，虫体软化透明为止。取出虫体置于清水中洗去碱液。清洗时要注意轻轻压挤虫体，使内容物排净或把虫体置于吸水纸上，轻轻压挤，使内容物排出后被吸水纸吸附，再将虫体置于清水中清洗。

染色：将清洗好的虫体分别置于100%硼砂卡红染液、90%硼砂卡红染液、80%硼砂卡红染液、70%硼砂卡红染液、60%硼砂卡红染液和50%硼砂卡红染液中24 h。

脱水：染色后的虫体在30%、40%、50%、60%和70%的乙醇中各脱水45 min，移入酸酒精中脱色30 s，取出虫体放入70%乙醇中冲洗，洗去虫体周围浮色，然后将虫体移入各级乙醇（80%、90%、95%、100%）中继续脱水1 h。

透明：将无水乙醇中的虫体挑出后，移入无水乙醇和丁香油原液比例为1:1的透明液中透明30 min，再用丁香油原液透明1 h。

封片：用挑虫针轻轻挑取透明后的虫体放在已洗净的载玻片上，距离磨砂面约2.5 cm处，用挑虫针调整虫体位置，然后在虫体处滴加适量中性树胶，用盖玻片封片，将制备好的玻片平放在载玻片架上，将其放入37℃温箱中直至排净气泡，取出后室温阴干。

2 结果

100%硼砂卡红染液 （图1）、90%硼砂卡红染液（图2）、80%硼砂卡红染液（图3、图4）、70%硼砂卡红染液（图5）、60%硼砂卡红染液（图6）、50%硼砂卡红染液（图7）和不染色（图8）。试验结果显示，经80%硼砂卡红染液染色过夜，制作残缘璃眼蜱玻片标本结构清晰，颜色鲜亮，染色后虫体整体为粉红色，假头和躯体界限分明。

图1 100%硼砂卡红染液（40×）

图2 90%硼砂卡红染液（40×）

图3 80%硼砂卡红染液（40×）

图4 80%硼砂卡红染液

图5 70%硼砂卡红染液（40×）

图6 60%硼砂卡红染液（40×）

图7 50%硼砂卡红染液（40×）

图8 虫体不染色（40×）

经80%硼砂卡红染液染色后，假头和躯体界限分明,假头的一对须肢细长由四节组成，每一节纤毫毕现；一对螯肢，位于两脚须之间，呈长杆状（图9）。躯体后缘的缘垛凸凹有致（图10）；四对足，每只足由六节组成，分别为基节、转节、股节、胫节、前跗节和跗节（图11）；足末端的爪和爪垫结构清晰、形态生动（图12）；哈氏器位于第一对足的跗节近端部的背缘上，呈泡腔状（图13）；雄蜱腹面的肛门、肛侧板和副肛侧板，后端的肛下板层次分明；雌蜱气门板往往呈逗点状，雄蜱气门板多为曲颈瓶状，具有窄而长的背突（图14）。

图9 螯肢和脚须（100×）

图10 缘垛（40×）

图11 足（40×）

图12 爪和爪垫（200×）

图13 哈氏器（100×）

图14 肛门、肛侧板和副肛侧板（40×）

3 讨论

蜱可传播多种病原，包括细菌、病毒和原虫等，其中一些病原具有人兽共患的特点，对人类和畜牧业生产危害极大。全球共有蜱类3科907种，硬蜱科约700种，软蜱科约200种，我国已描述定名的有2科10属125种，其中硬蜱科111种，软蜱科14种[9]，其分布广泛，生活习性各异，应根据不同蜱种的生物学特性，因地制宜，采用相应的防制措施，才能取得良好的效果。一种好的蜱种鉴定方法是有效防制措施的前提。

目前，传统形态学的鉴定方法和分子生物学手段都能运用到蜱虫的鉴定中，但对一些科研条件不允许的地方，传统形态学的鉴定方法就显得十分重要。本试验通过优化蜱虫硼砂卡红染液方法，借助解剖镜观察,并参考《中国经济昆虫志》，根据蜱虫形态学的描述对蜱虫进行鉴定[10]。蜱虫形态学鉴定时，将虫体染色，在染色过程中染液不宜过浓。若提高稀释倍数而延长染色时间，染色的效果反而更佳。稀释染液时，所用液体的含水量尽量与固定液的含水量相同或接近。本次试验将硼砂卡红染液原液按80%稀释，染色24 h后，虫体染色均匀，结构清晰，颜色鲜亮。

助色基团中具有酸性或碱性基团的染料分别称为酸性或碱性染色剂0。卡红粉末溶解于酸性或碱性溶液中才可以染色，两种卡红染液分别为醋酸卡红染液、硼砂卡红溶液0，其中以醋酸为溶剂的染液渗透作用快，染色后虫体结构清晰，染色标本不易褪色，但可能存在染色不均匀的现象；卡红以硼砂为溶剂进行染色，标本在制作完成后颜色质地均匀，不会出现染色过于浓郁的缺点。

本试验相较于其他标本的制作方法，其制成的玻片标本可以长期保存且不易褪色；玻片标本携带方便，便于老师教学示范；制作方便简易，不需要密封转盘、封片机等，有利于条件较差的基层工作者进行诊断鉴定；一次制作，反复使用，解决了教学资源紧缺的问题，节约试验材料，且便于学生观察。残缘璃眼蜱染色标本的制作方法有很多种，其中卡红染色方法操作简单，可重复性高，经济实惠，实用性高；该观察方法简便易于实施，且可以满足研究者的基本观察需要，尤其是在基层单位实验条件较差时也可以使用，更利于该方法的推广，使用更加具有普遍性。

4 结论

经80%硼砂卡红染液染色过夜，制作残缘璃眼蜱玻片标本结构清晰，颜色鲜亮，染色后虫体整体为粉红色，假头和躯体界限分明，且玻片标本可长时间保存。