泻火化瘀通窍法对感音神经性耳聋大鼠治疗效果的实验研究*

徐 锦 杨 悦 池万磊 熊高云

浙江省立同德医院 浙江 杭州 310012

感音神经性耳聋(SND)在全国持证残疾人中占绝大部分[1]。手术可恢复大部分传导性耳聋患者的听力，而SND病因复杂，手术虽具一定疗效，但因经济负担重而受限制，故如何有效治疗SND已成为诸多耳科学界学者研究的热点。耳蜗缺血再灌注损伤(CIRI)引起的耳血流微循环障碍是SND主要致病因素[2]。中医从整体调节入手，减少西药及手术引发的不良反应，可有效预防并发症，改善临床症状。泻火化瘀通窍法是将活血化瘀、清肝泻火有机结合，其对CIRI的防治作用仍未阐明。因此本文通过探究泻火化瘀通窍法对感音神经性耳聋的潜在作用机制及调控作用，为其提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物：60只体质量为200±20g的健康SD大鼠(SPF级)，从上海西普尔-必凯实验动物有限公司购买，饲养在浙江中医药大学实验动物研究中心。动物生产许可证号：SCXK(沪)2018-0006；饲养许可证号：SYXK(浙)2018-0012。自由饮水进食，适应性饲养1w。

1.2 主要实验材料与仪器：泻火化瘀通窍法组方(柴胡、栀子、川芎、红花、香附、甘草、枳壳各15g，石菖蒲、钩藤、夜交藤各25g，丹参、葛根各30g)，浓缩煎煮液至1.0g生药/ml，4℃冰箱保存备用。过氧化氢酶(CAT)试剂盒(货号：20190413购于南京建成)；白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒(货号：MM-0047R2、MM-0190R2、MM-0180R2)购于江苏酶免。脑干听觉诱发电位仪(丹麦MADSEN，型号：Octavus)；加热石蜡包埋系统(Leica，型号：G1150H)。

1.3 实验分组与CIRI模型制备：1w喂养完毕后，将SD大鼠随机分为模型组,泻火化瘀通窍低、中、高剂量组、地塞米松组,对照组，各10只，利用血管阻断法制备CIRI模型[3]。常规麻醉，固定，消毒备皮，于大鼠颈前正中作一切口，锁骨下动脉、分支椎动脉被暴露。用无菌小动脉夹夹住颈总动脉以形成局部缺血1h后释放，恢复供血，形成再灌注。对照组仅作切口，暴露相关动脉后缝合切口。模型组,泻火化瘀通窍低、中、高剂量组,地塞米松组模型制备后分别给予等剂量生理盐水,12.5、25.0、37.5g/kg·d-1泻火化瘀通窍方,20.0mg/kg·d-1地塞米松灌胃，对照组给予等剂量生理盐水灌胃，连续干预7d。

1.4 ABR阈值测试：给药结束后，在暗室中测量ABR阈值。除对照组测量实验开始前、处死前的ABR阈值外，其余组均选取造模后24h且未给药前、造模7d的两个时间点进行测量ABR阈值。

1.5 HE染色：耳蜗组织样本于4%多聚甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，制作切片，行HE染色。

1.6 ELISA检测血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平：参照相关ELISA试剂盒说明，检测大鼠血清中IL-1β、IL-6及TNF-α水平表达。

1.7 耳蜗组织中MDA含量及CAT活性水平的检测：参照相关试剂盒说明，检测各组大鼠耳蜗组织中MDA含量、CAT活性水平。

1.8 qRT-PCR检测耳蜗组织中HMGB1、RAGE的mRNA表达：取耳蜗组织样本100mg，总RNA通过试剂盒操作说明提取，RNA纯度、浓度和完整性通过紫外分析检测得出。逆转录反应合成cDNA，特异性扩增HMGB1、RAGE，以βactin为内参。HMGB1、RAGE的mRNA表达水平通过2-△△Ct方法计算得出。各引物序列见表1。

表1 HMGB1、RAGE、β-actin引物序列

1.9 统计学分析：采用SPSS 16.0软件，组间采用SNK分析，多组间用One-way-ANOAY单因素方差分析。方差不齐者采用非参数检验的Kruskal-Wallis H检验。所有数据以均值±标准差(±s)表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 泻火化瘀通窍法对ABR反应阈值的影响：与对照组相比，模型组ABR反应阈值明显增加(P＜0.01)；与模型组相比，各给药组ABR反应阈值均明显降低(P＜0.05、P＜0.01)，其中泻火化瘀通窍方作用效果呈剂量依赖性。具体见表2。

表2 各组大鼠ABR反应阈值(±s，n=10)

表2 各组大鼠ABR反应阈值(±s，n=10)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别ABR波反应阈值(dB SPL)地塞米松组30.67±3.73**对照组20.36±1.65**模型组65.24±6.05低剂量组53.89±7.66*中剂量组46.69±6.11**高剂量组42.94±6.50**

2.2 各组耳蜗毛细胞病理改变情况：对照组血管纹清晰，细胞结构正常；模型组耳蜗血管纹模糊，毛细胞缺损严重。相比模型组，低剂量组干预的大鼠耳蜗毛细胞无明显变化，而中剂量组耳蜗毛细胞形态结构基本清晰，高剂量组与地塞米松组大鼠耳蜗毛细胞没有明显损伤，细胞形态和结构清晰。见图1。

图1 HE染色下各组大鼠耳蜗毛细胞病理改变情况

2.3 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平的变化：与对照组相比，模型组TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高(P＜0.01)；与模型组相比，除低剂量组外，其他组都不同程度降低(P＜0.05，P＜0.01)，见表3。

表3 血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平变化情况(±s，n=10)

表3 血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平变化情况(±s，n=10)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别TNF-α(pg/ml)IL-1β(pg/ml)IL-6(pg/ml)地塞米松组52.02±13.16**82.82±11.92**87.88±9.59**对照组40.04±13.08**59.28±19.70**69.08±21.22**模型组96.62±18.45 176.36±17.82 146.76±21.22低剂量组91.27±14.96 165.65±31.21 124.18±14.85中剂量组75.59±6.57*108.33±16.18**112.70±18.59*高剂量组65.43±12.22**109.20±24.68**106.99±15.07**

2.4 各组耳蜗组织中MDA含量及CAT活性的变化：和对照组相比，模型组耳蜗组织中MDA含量明显增加(P＜0.01)，CAT活性显著降低(P＜0.01)；与模型组相比，高剂量组与地塞米松组可明显降低MDA含量(P＜0.05，P＜0.01)，各给药组均可增加 CAT活性(P＜0.05，P＜0.01)。具体见表4。

表4 耳蜗组织中MDA含量及CAT活性的变化情况(±s，n=10)

表4 耳蜗组织中MDA含量及CAT活性的变化情况(±s，n=10)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别MDAmmol/L CAT U/ml地塞米松组6.41±0.85**3.44±0.23**对照组4.62±1.13**24.41±2.87**模型组8.90±1.17 7.10±0.79低剂量组8.14±1.41 10.12±2.42*中剂量组7.34±2.17 17.17±2.93**高剂量组7.17±1.06*18.93±3.95**

2.5 qRT-PCR检测耳蜗组织中HMGB1、RAGE mRNA表达情况：模型组HMGB1和RAGE mRNA在耳蜗组织的表达明显增加(P＜0.01)；与模型组相比，除低剂量组，HMGB1和RAGE mRNA在耳蜗组织的表达没有明显改变(P＞0.05)。其他给药组均可明显降低HMGB1和RAGE mRNA的表达水平(P＜0.05，P＜0.01)。具体见表5。

表5 耳蜗组织中HMGB1、RAGE mRNA表达情况(±s，n=10)

表5 耳蜗组织中HMGB1、RAGE mRNA表达情况(±s，n=10)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别HMGB1 RAGE地塞米松组1.350±0.151**1.234±0.148**对照组1.009±0.165**1.004±0.107**模型组2.387±0.154 1.901±0.026低剂量组2.259±0.157 1.848±0.256中剂量组1.940±0.148*1.611±0.078**高剂量组1.668±0.158**1.577±0.133*

3 讨论

SND可归属于中医学“暴聋”范畴，“火”“瘀”为SND的主要病因，因肝胆与耳密切相关，故治疗多选用活血通络化瘀、泻火清肝养心之法。泻火化瘀通窍方中柴胡、钩藤、栀子、石菖蒲疏肝利胆、清热泻火、活血开窍，是为君；丹参、红花、葛根、川芎通络祛瘀、行气开郁、活血止痛，是为臣；佐以枳壳、夜交藤、香附，通络安神、解郁疏肝；配以甘草调和诸药。众药并行，可清肝泻火、活血化瘀，标本兼治[3]。

ABR可反应听觉系统传导通路功能是否存有障碍。本研究通过血管阻断法制备CIRI模型大鼠，对其ABR阈值进行检测，得出泻火化瘀通窍法可改善听神经功能，可能是与改善内耳微循环、局部血流量及保护神经纤维有关。HE染色结果显示给予泻火化瘀通窍方，可有效改善耳蜗毛细胞损伤，且可恢复正常的细胞形态结构，进一步证实泻火化瘀通窍法可有效改善CIRI，改善听力障碍，可能与方剂中活性成分葛根素下调iNOS表达，改善听力功能等有关[4]。

HMGB1是一类非组蛋白的促炎因子，抑制HMGB1表达，可介导募集、迁移嗜中性粒细胞，改善肾脏缺血再灌注损伤。此外，跨膜蛋白RAGE受体可与HMGB1结合参与炎症反应，激活NF-κB，TNF-α、IL-1β、IL-6被释放出。通过qRT-PCR，发现经泻火化瘀通窍方干预处理，HMGB1、RAGE mRNA均显著下调，提示泻火化瘀通窍法可通过抑制HMGB1/RAGE信号通路发挥改善CIRI的作用。

MDA可干扰酶活性、核酸等的代谢，MDA含量的高低与细胞损伤程度密切相关。体内自由基不能全部清理除尽，CAT活性降低，会使耳蜗组织损伤进一步加重[5]。此研究中，一定剂量的泻火化瘀通窍方治疗能使CAT的活性水平增加，并使MDA含量降低。这进一步表明，通过阻遏HMGB1/RAGE信号转导途径，泻火化瘀通窍方可以介导氧化应激反应并改善耳蜗微循环障碍。

综上所述，泻火化瘀通窍法对CIRI大鼠具有保护作用，主要通过下调HMGB1、RAGE表达，炎症反应及氧化应激反应被抑制来实现。