α-1,3-岩藻糖基转移酶IV在肝癌转移中的表达及机制研究

倪磊 郭健 于雪 张凝 韩依影 杨瑜爱 杨建仁 李春蕊 贾娟 刘天华

肝癌作为世界范围内最为常见的恶性肿瘤之一，死亡率位居第四位，由于其本身恶性程度高、侵袭能力强、发展迅速，故而预后较差[1-2]。α-1,3岩藻糖基转移酶IV(α-1,3-fucosyltransferase IV, FUT4)可以催化岩藻糖残基由UDP-Fuc转移至N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine, GlcNAc )并形成α-1,3-糖苷键，从而参与路易斯抗原Y (Lewis antigen Y, LeY)的形成，其表达水平在乳腺癌、肺癌、结直肠癌等多种肿瘤转移过程中均有所提高[3-6]。然而，在肝癌转移过程中FUT4的表达及相关机制仍需进一步探究。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮细胞获得间质特征的生物学过程[7]。EMT过程中，细胞会发生向纺锤形间质细胞形态的转变，以E-钙黏蛋白(E-cadherin)等为代表的上皮标志物的表达会发生下调，而以N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)等为代表的间质标志物的表达会发生上调[8]。EMT能够增强细胞的迁移、侵袭及抗凋亡能力，被认为是大多数上皮细胞来源于恶性肿瘤侵袭转移的基础[9]。本研究主要通过检测不同转移潜能肝癌细胞以及人肝癌MHCC97L细胞EMT模型中FUT4的表达水平，并借助生物信息学分析获取FUT4在转移与非转移肝癌样本中的表达水平和共表达基因，进行KEGG通路富集分析，探究FUT4在肝癌转移中的表达及机制，以期为肝癌转移的诊断和治疗提供新的思路和依据。

材料与方法

一、实验材料

(一)细胞 人肝癌细胞MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3为本实验室冻存，复苏使用；其中MHCC97L为低转移潜能人肝癌细胞，MHCC97H、HCCLM3为高转移潜能人肝癌细胞。

(二)试剂 TGF-β1(美国R&D公司)，RNA提取试剂盒(广东广州美基生物科技有限公司)，逆转录试剂盒(美国ThermoFisher Scientific公司)，E-钙黏蛋白抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，N-钙黏蛋白抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，波形蛋白抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，GAPDH抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，辣根过氧化物酶标记二抗(上海康成生物工程有限公司)。

二、实验方法

(一)细胞培养 实验所需人肝癌细胞MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，于37℃、5% CO2恒温培养箱中进行培养。

(二)人肝癌MHCC97L细胞EMT模型 人肝癌MHCC97L细胞以1×105/孔接种于六孔板中，采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养24 h。更换无血清DMEM培养基，加入10 ng/mL TGF-β1诱导72 h，以无血清DMEM培养细胞为对照，显微镜下观察细胞形态变化。

(三)qRT-PCR检测 采用RNA提取试剂盒提取不同转移潜能肝癌细胞以及对照组和TGF-β1诱导人肝癌MHCC97L细胞EMT模型组总RNA。以2 mg RNA为模板进行cDNA的逆转录合成，随后进行qRT-PCR反应，扩增程序设定为：95 ℃，5 min；95 ℃，10 s，60 ℃，30 s，72 ℃，20 s，共40个循环；以GAPDH为内参，所用引物序列如下： FUT4-forward 5′-TCCTACG-GAGAGGCTCAG-3′，FUT4-reverse 5′-CCTCGTAGTC-CAACACG-3′；E-cadherin-forward 5′-GAATGACAAC-AAGCCCGAAT-3′，E-cadherin-reverse 5′-GACCTCCA-TCACAGAGGTTCC-3′；N-cadherin-forward 5′-GGTG-GAGGAGAAGAAGACCAG -3′，N-cadherin-reverse 5′-CATCAGGCTCCACAGT-3′；Vimentin-forward 5′-TG-GTTGCTTCAAGGACACAT-3′，Vimentin-reverse 5′-GTTGCAGTGAGGGCAAGAA-3′；GAPDH-forward 5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′，GAPDH-reverse 5′-GAGGGGAGATTCAGTGTGGT-3′。

(四) Western blot检测 提取对照组及TGF-β1诱导人肝癌MHCC97L细胞EMT模型组总蛋白，经BCA蛋白浓度检测试剂盒定量后与5×SDS上样缓冲液混匀，煮沸。取等量蛋白上样，经10% SDS-PAGE分离后，采用半干电转移的方法将条带转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h；分别加入E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白、GAPDH抗体稀释液，4 ℃孵育过夜；0.1% TBST洗膜3次后加入二抗，室温孵育1 h；0.1% TBST洗膜3次后采用ECL化学发光法检测蛋白条带。

(五)生物信息学分析 采用人类肿瘤转移数据库(Human Cancer Metastasis Database, HCMDB)检索转移与非转移肝癌样本中FUT4的表达水平及共表达基因相关数据[10]。将FUT4及其共表达基因导入OmicsBean数据库进行KEGG通路富集分析。

三、统计学处理

实验数据采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，两组之间比较采用t检验，设定P<0.05具有统计学差异。

结 果

一、FUT4在不同转移潜能肝癌细胞中的表达

采用qRT-PCR检测不同转移潜能肝癌细胞MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3中FUT4的mRNA表达水平。结果显示，与低转移潜能人肝癌MHCC97L细胞相比，高转移潜能人肝癌细胞MHCC97H与HCCLM3中FUT4的表达水平均显著提高(P<0.01)，分别为MHCC97L细胞中的4.99倍和6.08倍。

二、 TGF-β1诱导人肝癌MHCC97L细胞EMT模型的建立

通过TGF-β1诱导人肝癌MHCC97L细胞构建EMT模型，于显微镜下观察。结果如图1A所示，与对照组相比，经TGF-β1诱导72 h后MHCC97L形态由多边形变为纺锤形。

qRT-PCR检测对照组及TGF-β1诱导人肝癌MHCC97L细胞EMT模型组EMT标志分子的mRNA表达水平。结果如表1所示，与对照组相比，经TGF-β1诱导后细胞中上皮标志物E-钙黏蛋白表达水平显著降低(P<0.001)，为对照组的0.63倍；而间质标志物N-钙黏蛋白与波形蛋白表达水平均显著提高(P<0.001)，分别为对照组的3.10倍和1.58倍。Western blot检测对照组及TGF-β1诱导人肝癌MHCC97L细胞EMT模型组EMT标志分子的蛋白表达水平，结果显示蛋白表达变化与mRNA表达变化一致(图1B)。

表1 qRT-PCR检测TGF-β1诱导MHCC97L细胞EMT标志分子的表达水平

(A)TGF-β1诱导MHCC97L细胞的形态变化；(B)Western blot检测TGF-β1诱导MHCC97L细胞EMT标志分子的表达水平

三、FUT4在TGF-β1诱导人肝癌MHCC97L细胞EMT模型中的表达

采用qRT-PCR检测对照组及TGF-β1诱导人肝癌MHCC97L细胞EMT模型组FUT4的mRNA表达水平。结果显示，与对照组相比，在TGF-β1诱导人肝癌MHCC97L细胞EMT模型组中FUT4的表达水平显著提高(P<0.01)，为对照组的1.42倍。

四、 转移与非转移肝癌样本中FUT4的表达水平及共表达基因

通过HCMDB数据库检索转移与非转移肝癌样本中FUT4的表达水平及共表达基因的相关数据。实验EXP00134 (Dataset ID: GSE40367)显示，与非转移肝癌样本相比，转移肝癌样本中FUT4的表达水平提高，差异具有统计学意义(P<0.01，图2A)；并且进一步获取了包括SPINT1、FUT8、PROM1、ITGB8、 ITGA3、 ITGB4等在内的200个FUT4共表达基因。

(A)HCMDB数据库检索转移与非转移肝癌样本中FUT4的表达(**, P<0.01)；(B)FUT4及其共表达基因的KEGG通路富集分析

五、FUT4及其共表达基因的KEGG通路富集分析

将由HCMDB数据库检索获得的FUT4共表达基因与FUT4一起输入OmicsBean数据库，进行KEGG通路富集分析。结果如图2B显示，富集到了肿瘤转录调控异常(Transcriptional misregulation)、肌动蛋白细胞骨架调节(Regulation of actin cytoskeleton)以及ECM受体相互作用(ECM-receptor interaction)等KEGG通路。

讨 论

FUT4作为岩藻糖基转移酶家族一员，与肿瘤侵袭转移密切相关。已有文献报道表明，FUT4可以作为乳腺癌早期诊断和病程监测的潜在分子标志物[4]。然而，关于肝癌转移中FUT4的表达及相关机制仍有待进一步探究。基于此，本研究不仅通过检测不同转移潜能肝癌细胞中FUT4的表达证实了其在高转移潜能肝癌细胞中表达水平显著提高，并且通过TGF-β1诱导人肝癌MHCC97L细胞建立了EMT模型，进一步验证了FUT4表达的变化；此外，还借助生物信息学的方法获取了转移与非转移肝癌样本中FUT4的表达水平及共表达基因，并且对FUT4及其共表达基因进行了KEGG通路富集分析。

在KEGG通路富集分析结果中，共表达基因SPINT1、FUT8、PROM1等被富集到了肿瘤转录调控异常通路。已有报道证实，SPINT1的表达水平与分化型甲状腺癌的淋巴结节转移以及复发高风险存在紧密关联[11]。FUT8与FUT4同为岩藻糖基转移酶家族成员，其可以通过影响TGF-β 受体促进乳腺癌细胞的侵袭转移[12]；在前列腺癌细胞中上调FUT8则可以通过影响胞外囊泡糖蛋白的糖基化修饰促进转移[13]。PROM1又被称为CD133，目前已被证实在胰腺癌中其表达水平与淋巴转移密切相关[14]。共表达基因ITGB8在肺癌中可以通过影响转移相关基因的表达，改变侵袭表型，在肿瘤转移过程中发挥重要的作用[15]；在结直肠癌中，ITGB8的异位表达则可以抑制细胞侵袭，影响肿瘤转移[16]。ITGA3同样为FUT4的共表达基因，通过敲减其表达可以抑制头颈部鳞状细胞癌细胞和前列腺癌细胞的迁移侵袭[17-18]。而共表达基因细胞黏附分子ITGB4的高表达则已被证实与宫颈癌淋巴结节转移以及不良预后存在密切关联[19]。KEGG通路富集分析结果提示，共表达基因ITGB8、ITGA3以及ITGB4不仅参与了肌动蛋白细胞骨架调节，还参与了ECM受体相互作用。由此可见，FUT4及其共表达基因可能通过肿瘤转录调控异常、肌动蛋白细胞骨架调节、ECM受体相互作用等KEGG通路参与肝癌转移过程。

总之，本研究完成了对FUT4在肝癌转移中的表达及机制的初步探索，并且为肝癌转移的诊断和治疗提供了以FUT4为潜在生物学标志物与靶点的新思路。