乙型肝炎及其慢性化机制研究进展*

张 莹 聂红明 汪 蓉 姜煜资 俞嫣青 王灵台

1.上海中医药大学附属曙光医院 (上海，201203) 2.上海中医药大学 3.上海市浦东新区中医医院

我国是乙型肝炎病毒(HBV)感染的高发地区, 世界卫生组织曾提出“至2030年消除病毒性肝炎重大公共卫生威胁”的终极目标。全球约20亿人曾感染HBV,其中2.4亿人为慢性HBV感染者，每年约有65万人死于HBV感染所致的肝功能衰竭、肝硬化和肝细胞癌(HCC)。2006年全国乙型肝炎血清流行病学调查表明,我国1～59岁人群乙肝表面抗原(HBsAg)携带率为7.18%[1],据此推算,我国慢性HBV感染者约有9 300万人,其中慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者约2 000万例。我国每年有超过100万人死于本病所致的肝硬化、肝癌及肝衰竭。虽然近年来已加大乙型肝炎免疫疫苗的接种和普及，但HBV感染在我国仍是一种严重危害人民健康的传染病。CHB发病率高，且易发展为肝硬化、原发性肝癌及肝衰竭，最终导致死亡。目前HBV感染后的慢性化机制尚未明确，本文综合最新国内外进展对HBV感染后慢性化的发生机制行综述。

1 宿主因素

HBV侵入机体后，形成慢性感染与宿主抗病毒免疫应答密切相关。机体免疫系统发育成熟程度是HBV持续性感染的重要因素。胎儿及新生儿免疫系统尚未成熟，此时容易发生免疫耐受。研究表明，乙肝携带者主要与母婴传播方式有关[2]。成人感染HBV后，病毒侵入肝细胞形成cccDNA不断进行复制，激发人体的非特应性与特异性免疫应答，进一步对肝脏造成损伤。同时乙型肝炎慢性化还与宿主的HLA基因型差异有关，使得HBV肝外不断复制得以免疫逃逸而致慢性化。

1.1 免疫应答

1.1.1 非特异性免疫 非特异性免疫系统主要包括：组织屏障、固有免疫细胞(吞噬细胞、杀伤细胞、树突状细胞等)和固有免疫分子(补体、细胞因子、酶类物质等)。

1.1.1.1 自然杀伤细胞(NK细胞)NK细胞为免疫监视细胞,在病毒感染的过程中NK细胞首先做出反应，并抵御病毒的入侵。虽然NK细胞在外周血淋巴细胞中所占比例从5%～15%不等，但其在肝内淋巴细胞中所占比例高达50%。在CHB发病、发展及转归中,特别是在终止HBV感染和造成肝细胞免疫损害方面都可能有重要作用。NK细胞在缺乏抗体的情况下或通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)对病毒感染细胞或癌细胞具有细胞毒性。在慢性HBV感染中，NK细胞的表型和功能可能与感染阶段有关。此外NK细胞对HBV特异性T细胞的调节作用，降低T细胞的抗病毒活性，抑制适应性免疫反应，可能会对控制病毒的总体作用产生负面影响[3]。在CHB患者中发现NK细胞的功能缺陷，主要表现为失活状态。Aichao Shi等[4]人通过研究干扰素组与单纯性恩替卡韦组相比，发现干CD56bright NK细胞可能通过TRAIL/TRAIL-R的溶细胞途径和 IFN-γ及TNF-α上调APOBEC3A和APOBEC3B蛋白，间接非溶细胞途径清除HBSAg。此外，HBV诱导的抑制性单核细胞通过培养调节性NK细胞抑制HBV特异性T细胞免疫应答，进而导致HBV慢性持续感染。

1.1.1.2 树突样细胞(DC) DC是最有效的专职性抗原递呈细胞(APC),能激活初始型T细胞, 启动控制HBV感染的免疫反应,产生CTL,清除病原体。HBV DC亚群的研究主要局限于从外周血分离的髓样树突状细胞(mDCs)和浆细胞样树突状细胞(pDCs)。慢性HBV感染常显示DC功能受损。Xiaoyan Li等人[5]研究发现CHB患者髓系树突状细胞(MDCs)和浆细胞样树突状细胞(PDCs)的频率均低于健康对照组，恩替卡韦(ETV)抗病毒治疗后，PDCs频率和MDCS成熟标志物表达增加，基线HBsAg水平是影响DC的重要因素。在基因表达分析中，发现CAB患者免疫相关基因表达水平显著降低。在这些基因中，白细胞介素-6信号转导蛋白(IL6ST)的表达水平与DC表面标志物的表达水平呈正相关。调节DC中IL6ST的表达水平，并用抑瘤素M治疗，可使DC功能恢复。

1.1.1.3 Toll样受体(TLR) TLR是参与非特异性免疫(天然免疫)的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。TLR是单个的跨膜非催化性蛋白质，可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子。TLRs主要表达于免疫细胞，包括巨噬细胞、DC、B细胞和T细胞。有研究将健康人外周血单个核细胞(PBMC)的单核细胞极化成M1/M2巨噬细胞，并通过TLR2信号通路检测乙型肝炎核心抗原(HBcAg)对巨噬细胞极化和功能的影响[6]。结果表明，HBcAg对M1极化影响不大，但能有效削弱M2极化，促进促炎细胞因子IL-6和TNF-α的产生。由此可知，HBC Ag可通过TLR2途径削弱M2巨噬细胞的极化，同时促进炎性细胞因子的产生。此外，一些研究报道TLR的表达可以介导NK细胞的强烈激活。TLR5基因变异可能在HBV相关严重肝病的发生中起一定作用[7，8]。

1.1.1.4 干扰素系统(IFN) IFN是病毒感染后免疫细胞产生的一种糖蛋白，分为α和β两型，可通过抑制乙肝病毒的复制直接抗病毒，此外还具有免疫调节作用。其中干扰素-α-2作为目前研究最多的亚型，已被用于治疗HBV感染，具有疗程短、病毒学应答持续等优点。研究发现，干扰素α亚型14可有效地诱导肝内干扰素γ和α的协同应答，并与有效抑制HBV有关[9]。Akpolat等[10]研究表明IFN-γ与CHB慢性化过程相关。

1.1.2 特异性免疫 HBV感染机体刺激特异性免疫系统(T细胞、B细胞、调节性T细胞)分泌细胞毒颗粒或增强其它免疫细胞功能，达到发挥抗病毒作用。T细胞是起主要作用的免疫细胞，包括细胞毒性T细胞、辅助性T细胞(Th细胞)、调节性T细胞(Treg细胞)，参与机体细胞及体液免疫反应。B细胞可分化为浆细胞，浆细胞可合成和分泌抗体(乙肝抗体)，主要执行机体的体液免疫。

1.1.2.1 细胞毒性T淋巴细胞(CTL)CTL是机体细胞免疫中起重要作用的细胞，可通过穿孔蛋白途径和FaS/FaSL介导的细胞凋亡途径对靶细胞产生细胞毒作用。还能分泌细胞因子，如干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-12(IL-12)，直接抑制HBV复制和表达，完全清除肝细胞内的病毒。CTL是CD8+T细胞的效应阶段。HBV复制的抑制与循环CD8+T细胞数量的增加有关。CD8+T细胞是抗肿瘤、抗病毒免疫的主要效应细胞之一。慢性HBV感染通常表现为病毒特异性T细胞反应性弱或缺乏，被描述为“衰竭”状态。CHB和HCC均存在CD8+T细胞耗竭现象[11]。此外，还发现前列腺素E2通过损害CTL功能促进HBV复制[12]。研究表明，CTLA-4水平和CTLA-4 rs231775多态性与慢性HBV感染的病情进展和HCC发生有关[13]。

1.1.2.2 辅助性T细胞(Th) 由初始CD4+T细胞分化而成, 通过分泌细胞因子来相互影响对方细胞的分化与增殖。Th1在自身免疫病、器官移植排斥反应、抗感染的诱导过程中起到重要作用,主要介导细胞免疫应答。Th2在过敏反应中起主导作用,主要介导体液免疫。Th1/Th2细胞平衡关系可能影响乙肝的慢性化发生及持续[14]。CHB慢性化患者体内存在Th2型细胞占优势的状态。

1.1.2.3 调节T细胞(Treg) Treg细胞是一类具有免疫抑制功能的T细胞亚群，是细胞免疫中重要的调节细胞，在维持机体免疫耐受方面起着关键作用。Treg主要为CD4+、CD25+、Treg。马建平[15]发现CD4+、CD25+、foxp3+ T细胞在HBV感染者外周血中的比例明显高于健康人群，活动期比例明显高于恢复期，提示HBV感染者外周血CD4+、CD25+、foxp3+ T细胞介导的免疫耐受与感染后病情进展存在明显关系，能够直接参与肝脏免疫损伤。HBV感染后体内调节性 T 细胞表达水平上调，可促进病毒的复制，能够导致CHB慢性化。

研究表明，CHB肝硬化患者存在Treg/Th17失衡，外周血Treg细胞减少，Th17细胞增多，Treg/Th17比值降低。Treg与Th17细胞呈负相关。两者失衡参与了CHB肝硬化的发病机制，Treg/Th17比值可作为预测失代偿期肝硬化的潜在指标[16]。

1.1.2.4 B细胞 B细胞主要发挥体液免疫应答和抗原提呈作用。此外也具有免疫负调节作用。研究发现，CHB患者Bregs表达显著高于健康人群。Breg细胞增多可能是慢性乙型肝炎IL-10升高的主要来源，推测Bregs在HBV感染的过程中可能发挥了免疫负调节的作用，从而保护HBV逃脱宿主的免疫监控和免疫清除[17]。

1.1.2.5 库普弗细胞(KCs) KCs是指位于肝窦内表面的吞噬细胞，能够清除血液中的外来抗原、抗原-抗体复合物和细胞碎片等物质。KCs不仅可以维持免疫应答的动态平衡，而且通过其抗原提呈功能和可溶性介质的分泌，促进CHB的发病[18]。一方面，KCs具有天然免疫细胞的特性，有助于清除HBV。同时，KCs诱导对HBV的免疫耐受，从而导致感染的慢性化。

1.2 免疫逃逸 HBV以基因突变的形式逃逸机体的免疫监视作用，病毒因突变而改变了其对T细胞和B细胞的识别位点,使CTL或抗病毒中和抗体对HBV及其抗原不能进行有效的识别和应答。有研究发现HBsAg N-糖基化突变是病毒免疫逃逸的主要原因,并可感染免疫接种乙肝疫苗成功的患者。其中特异性HBsAg-MHR(主要亲水区)N-糖基化突变与HBV免疫逃逸有关[19]。“a”抗原决定簇为外壳蛋白最重要的中和部位,其变异可逃避抗体中和,引起持续感染。所有确定的N-糖基化位点都位于“a”决定簇的第一个环中，HBsAg-MHR N-糖基化突变在中国是一个很高的频率，并且可以在人群中水平传播。这些突变导致抗-HBs的结合性降低，增强了病毒的包膜和分泌。

1.3 人白细胞抗原(HCA)基因型 HBV感染与宿主免疫应答相关，个体的免疫应答取决于主要组织相容性复合体(MHC)。人类的MHC被称为HLA，HLA基因多态性影响HBV感染的结局[20]。某些HLA基因型可能会促进HBV感染的慢性化，如HLA-DQA1*0302、HLA-DRB1*03、HLA-DRB1*07等；有些则HBV感染慢性化起抑制作用，如HLA-DQA1*0301、HLA-DQA1*1102等。

1.4 细胞因子 HBV感染是一种包括免疫应答在内的复杂多因素共同作用的过程。机体感染HBV后对肝细胞没有直接损伤，而是诱发机体免疫应答间接损伤肝细胞。细胞因子在免疫系统中起着重要的调控作用。如IL-10可抑制单核细胞依赖性辅助性T细胞增生，可抑制DC的分化成熟导致HBV感染慢性化，抑制炎症因子的分泌，减轻肝损伤，但不利于机体对病毒的清除[21]。研究表明，IL-10基因启动子区域和内含子序列多态性与CHB的慢性化和HBV肝损伤有关[22]。IFN-γ与IL-4水平比例失衡可能与患者HBV持续感染有关，导致HBV无法清除[23]。白细胞介素-17(IL-17)作为一种促炎细胞因子，已被发现在感染性和炎症性疾病中调节免疫系统。有研究表明IL-17A rs10484879单核苷酸多态性基因型可能与HBV慢性感染易感性有关[24]。

1.5 补体成分 补体是一组具有酶活性的糖蛋白，是机体重要的免疫效应系统之一，主要存在于人和脊椎动物正常血清及组织液中，血清补体C3、C4与CHB患者的肝功能有相关性[25],Ning G[26]通过比较CHB患者肝组织和血清中C2的表达发现其明显低于健康对照组，HBV可能通过抑制C2的表达来促进CHB患者的病毒持久性。

2 病毒因素

HBV感染的自然史CHB的自然史是由病毒、宿主和环境因素的复杂相互作用决定的，特定病毒学因素对CHB病程的影响越来越受到人们的重视。

2.1 病毒载量 HBV是一种包膜病毒，其环状和部分双链DNA基因组约为3.2 kb。肝细胞感染后，HBV基因组进入细胞核，HBV在感染的肝细胞的细胞核中建立一个共价闭合环状DNA(cccDNA)池。cccDNA以微小染色体的形式存在，对抗病毒药物具有抵抗力，因此从感染细胞中清除cccDNA仍然是不可能的[27]，这是CHB难以治疗的原因。低水平的残留HBV仍可能促进纤维化进展。研究表明，在HBeAg阴性的患者中，肝内HBV DNA的升高与肝脏炎症和纤维化的组织学证据相关，而在HBeAg阳性的患者中则没有观察到这种趋势[28]。Lemonica Koumbi[29]通过19例CHB患者进行血清病毒血症和肝脏HBV RNA检测。检测HBV RNA、NKG2D配体等在CHB患者和转染细胞中的表达发现，CHB患者HBV的高复制上调了所有NK细胞配体的mRNA，特别是抑制性NK细胞配体LLT1的mRNA表达。

2.2 病毒HBV DNA基因型 不同的HBV基因型被证明是慢性HBV感染临床进程的重要预测因子。根据整个HBV基因组序列的遗传差异，至少有10个HBV基因型(A到J)和几个亚型被鉴定出来[30]，它们在整个基因组序列中的差异大于8%，其中基因型B和C是在亚太地区常见。在体外研究中，基因型C的细胞内HBV DNA表达高于B，基因型D的细胞内hbvdna表达高于A。一项对460名HBeAg阴性、无肝硬化、停用恩替卡韦或TDF治疗至少12个月的患者回顾性研究表明[31]，B型HBV感染者病毒学和临床复发再治疗的比例均显著高于C型感染者(P<0.05)，且与之相匹配的疱疹倾向也明显高于B型感染者(P<0.01)。基因C型及混合型的HBV-DNA载量明显高于B型患者, 病毒复制更为活跃，传染性强，对肝脏细胞的破坏更为严重,预后较差, C基因型HBV比B型更易产生肝脏病变[32，33]。

2.3 病毒基因变异 HBV属DNA病毒，为部分环状双股DNA，基因组长约3.2 kb，包括前S/S区(pre-S/S区)、前C/C区、P区和X区。基因常见突变主要有点突变、缺失突变和起始密码子突变。S基因编码HBsAg，S基因区的变异可引起HBsAg抗原性的改变，从而可能导致HBsAg的假阴性诊断和免疫逃避HBV。前S基因突变可能与HBV复制缺陷有关，这可能是观察到的HBsAg低表达的原因。HBV PreS基因由PreS1和PreS2构成，分别编码PreS1和PreS2蛋白，前者含有肝细胞结合位点，与病毒颗粒的包装有关，PreS基因变异可能与HBV隐匿性感染和进展性肝脏疾病相关。研究表明，HBV PreS基因变异在CHB感染不同阶段的分布差异，其中PreS缺失变异与CHB相关肝硬化发生及进展至失代偿期显著相关[34]。C区编码核心蛋白和e蛋白。HBV前C(PC)区和基本核心启动子(BCP)区基因变异后加强病毒复制能力和致病性增强，机体免疫原性改变以及影响免疫应答，使HBV逃避宿主的免疫清除，导致持续感染并加重肝细胞损害[35]。P读码框编码DNA聚合酶，具有反转录活性;P区基因突变主要见于POL/RT基因片段，导致耐药株的出现;X区与病毒复制转录有关。HBV X基因(核苷酸位点1374～1838)编码的HBx蛋白是病毒分泌的包含154个氨基酸的一个多功能调节蛋白，和肝细胞的恶性转化密切相关，HBx区突变可显著增加肝癌的发生风险[36]。

2.4 病毒抗原 HBsAg、HBeAg与HBsAg本质是糖基化包膜蛋白，是由肝细胞整合、DNA转录与翻译后产生的，HBeAg阳性与HBsAg阳性均与HBV DNA水平呈正相关[37]。血清HBsAg和HBeAg水平与HBV慢性感染免疫清除期的肝脏病理分期有关。在一项聚乙二醇干扰素(PEG-IFN)联合核苷类似物(NAs)治疗慢性乙型肝炎的研究发现，低基线HBV DNA和低HBsAg水平的患者比其他人群更快地实现HBsAg清除[38]。Nina[39]研究发现HBs特异性T细胞的数量与血清HBsAg水平呈正相关。在对慢性HBV感染者免疫细胞的分析中，发现HBsAg暴露时间而不是HBsAg的量与抗HBV免疫应答水平有关。

HBeAg是HBV核心颗粒中的一种可溶性蛋白质。一般情况下埋藏于HBcAg内部，当HBcAg裂解时，HBeAg从肝细胞核内溶入血清，它的出现迟于HBsAg，而消失却早于HBsAg。此外，HBeAg通过PI3K和NF-κB信号途径增加巨噬细胞miR-155的表达，miR-155通过抑制BCL-6、SHIP-1和SOCS-1的表达促进HBeAg诱导的炎性细胞因子的产生,引起肝细胞损伤[40]。

3 小结

NAs治疗可有效抑制HBV DNA复制,但HBeAg血清学转换率及HBsAg清除率均较低，难以实现临床治愈。了解CHB的发病机制有助于指导其临床监测、治疗及预防。HBV感染慢性化不是单一因素作用的结果,与宿主本身、病毒基因型、病毒载量等多因素相关。现代研究主要集中于患者与健康者的相关实验室指标的比较，来推测其与乙肝慢性化相关程度，进一步应用于临床治疗还需要继续深入研究和辨析。