高效液相色谱法测定染发剂中羟乙基对苯二胺硫酸盐和对苯二胺

谢 静，郑 抒，秦 剑

(重庆食品药品检验检测研究院，重庆 401121)

染发剂作为一种发用化妆品应用历史悠久，经过长期的发展到现在已经拥有很多系列，其中氧化型染发剂由于其染发效果好、持续时间长而应用最广泛[1]。羟乙基对苯二胺硫酸盐和对苯二胺都属于氧化型染发剂，有研究表示[2]羟乙基对苯二胺硫酸盐较对苯二胺有更强的染发效能，而且对头发损伤更小，所以其在染发剂中被广泛使用，目前国家标准中规定了75种染发剂的限度要求[3]，其中就包括羟乙基对苯二胺硫酸盐和对苯二胺，但是在检验方法上存在巨大的空白[4]。羟乙基对苯二胺硫酸盐与对苯二胺是化学性质相近的两种物质，目前染发剂检验的国家标准是化妆品安全技术规范2015年版规定[5]的32种染发剂的检验法，但是方法中的32种染发剂并不包括羟乙基对苯二胺硫酸盐，实验中发现，以此种方法检验时，羟乙基对苯二胺硫酸盐和对苯二胺在同一时间出峰，并且两种物质的紫外图谱一致，在实际检验工作中，极易造成错误，将样品中含有的羟乙基对苯二胺硫酸盐当作对苯二胺检验。另外，在检验过程中发现染发剂生产企业在投料时也经常将二者混淆。所以说，建立一种新的高效液相色谱方法，能使二者有效的分离，又能弥补羟乙基对苯二胺硫酸盐在检验方法上的空白，实在是迫在眉睫。此次试验旨在解决这一问题。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

Waters e2695型高效液相色谱仪-二极管阵列检测器，美国Wterse公司。

标准品羟乙基对苯二胺硫酸盐，购自damas-beta(批号P03568)；对苯二胺，购自CHEN SERCICE(批号7799500)；亚硫酸氢钠、十二水和磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、庚烷磺酸钠、无水乙醇均为分析纯，甲醇、乙腈均为色谱纯，水为超纯水。染发剂5批，其中1批为液体，其余四批为乳膏状。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：SUPELCO C18柱(25 cm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈+磷酸盐缓冲液(十二水和磷酸氢二钠1.8 g、磷酸二氢钾2.8 g、庚烷磺酸钠1.0 g加水定容至1000 mL,，磷酸调pH至6.0)=13:87；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：280 nm；进样量：5 μL。

1.2.2 标准溶液的配制

精密称取羟乙基对苯二胺硫酸盐、对苯二胺对照品0.05 g(精确到0.05000 g)分别至25 mL容量瓶中，前者用2 g/L亚硫酸氢钠水溶液溶解并定容，后者以无水乙醇+2 g/L亚硫酸氢钠水溶液(1+1)混合溶液溶解并定容，配制成浓度为2 mg/mL的标准储备液，精密量取上述单表储备液各5.0 mL至同一25 mL容量瓶中，用无水乙醇+2 g/L亚硫酸氢钠水溶液(1+1)混合溶液稀释至刻度，配制成浓度为400 μg/mL的混合标准溶液。

1.2.3 样品的制备与检测

精密称取样品0.2 g置于10 mL离心管中，加无水乙醇+水(1+1)的混合溶液至刻度，涡旋3 min，振荡提取30 min，离心，上清液经0.45 μm滤膜过滤，取续滤液作为供试液进样分析。

1.2.4 方法学考察

线性关系：精密量取对照品溶液适量，用无水乙醇+2 g/L亚硫酸氢钠水溶液(1+1)混合溶液稀释至浓度为8 μg/mL、16 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL的线性标准溶液。将线性标准溶液注入液相色谱仪，得到峰面积，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标得到回归方程。精密度：浓度为40 μg/mL的混合标准溶液连续进样6次，计算6次峰面积的相对标准偏差。

2 结果与讨论

2.1 流动相比例和提取溶剂的选择

《化妆品安全技术规范》2015年版规定了32种染发剂的检验方法，其中对苯二胺检验的流动相为乙腈+磷酸盐缓冲溶液(10+90)，试验中以此为流动相分离两组分，发现两组分色谱峰完全重合在一起。加大水相比例以及加大乙腈比例至15%后，前者出峰时间延后，后者提前，但是两组分仍不能有效分离。将乙腈比例调节到13%后，两组分可以达到很好分离。实验同时考察流速为0.8 mL/min、1.0 mL/min时的分离效果，发现流速为0.8 mL/min时不能很好分离，而1.0 mL/min分离效果较好。

《化妆品安全技术规范》2015年版规定染发剂的提取溶剂为无水乙醇+水(1+1)，试验考察了乙醇比例为50%、70%、100%，加入相同浓度的对照品，发现随者乙醇比例的提高，对苯二胺的峰面积变化不大，而羟乙基对苯二胺硫酸盐的峰面积减小，分析是因为盐类在含水量大的溶剂中更容易溶解，故采用50%乙醇水溶液为提取溶剂。

2.2 线性关系及检出浓度

在8～400 μg/mL范围内，该方法得到的两种染发剂的回归方程均呈良好线性关系，相关系数均大于0.9998；样品取样量为0.2 g，稀释至10 mL，最低检出浓度羟乙基对苯二胺硫酸盐为10 μg/g，对苯二胺为8 μg/g，色谱图见图1。

图1 羟乙基对苯二胺硫酸盐和对苯二胺色谱图Fig.1 Chromatograms of hydroxyethyl-p-phenylenediamineand p-phenylenediaminev

2.3 精密度试验

浓度为40 μg/mL的混合标准溶液连续进样6次，计算6次峰面积的相对标准偏差，两种染发剂的峰面积标准偏差分别为1.3%、0.8%，均小于2.5%，精密度良好，结果见表1。

表1 线性范围、线性方程、相关系数、检出限和精密度Table 1 Linearity rang、linear equation、correlation coefficient、detection limit and precision

2.4 加样回收试验

表2 不同基质的样品在低、中、高浓度的加标回收Table 2 Rate of recocery with different base material simple at low,middle and high concentrations

取两种不同基质的样品(液体状和乳膏状)进行加标回收试验。称取样品0.2 g，分别按照低(20 μg/mL)、中(100 μg/mL)、高(200 μg/mL)三种浓度加入对照品溶液。按样品处理方法处理，计算回收率。两组分不同基质的低、中、高回收率均在83%～116%之间(表2)。

2.5 样品分析

按照上述方法对市场上5批液体状、乳膏状染发剂进行检测，结果表明，含有羟乙基对苯二胺检出1批次，对苯二胺检出2批次。

2.6 实验的不足

虽然此次试验将两种物质有效的分离，但是出峰时间为 4 min左右，出峰时间较早，容易受溶剂峰和杂质峰影响，这是本试验未解决的问题。

3 结 论

本文建立的高效液相色谱方法，以乙腈+磷酸盐缓冲溶液(13+87)为流动相，检测波长为280 nm，操作简便，回收率和重现性较好，可以有效地分离羟乙基对苯二胺硫酸盐和对苯二胺，同时建立了染发剂中羟乙基对苯二胺硫酸盐的检验方法。