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Cocktail探针药物法研究化合物PT-46的CYP酶系抑制作用*

2021-11-18王丽丽张娜娜郑雪梅张吉泉

广州化工 2021年21期
关键词:微粒体底物孵育

王丽丽,程 飞,张娜娜,郑雪梅,张吉泉,,陈 瑞

(1 贵州医科大学/贵州省化学合成药物研发利用工程技术研究中心,贵州 贵阳 550025;2 贵州医科大学药学院,贵州 贵阳 550025)

癌症(又称恶性肿瘤)的发病率和死亡率逐年上升,已成为世界范围内的主要公共卫生问题。据世界卫生组织最新发布的《2020全球癌症报告》显示,2018年全球新增癌症并列1810万例,死亡960万例。其中,我国新增癌症病例380.4万例、死亡229.6万例[1]。相比于其他国家,我国癌症的发病率和死亡率位列全球首位。因而,抗肿瘤药物的研发面临巨大的临床需求。

靶向磷脂酰肌醇-3 激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路成为近年来抗肿瘤创新药物研究的热点[2-3]。化合物PT-46是课题组前期研究得到的取代苯并咪唑抗肿瘤活性优选化合物(图1),是一个PI3K/mTOR双靶点抑制剂[4]。该化合物在HCT116细胞上具有较高的抗增殖活性(IC50值为0.3 μM,为阳性对照PF-05212384的4.67倍)[4],是一个值得进一步研究和开发的抗肿瘤优选化合物。

图1 PT-46的化学结构Fig.1 The chemical structure of PT-46

药物主要是在肝脏里面代谢,其中细胞色素CYP(P450)酶是其主要的代谢酶,主要包含的CYP3A4、2C19、2C9、2D6、1A2酶参与了体内大约80%以上的药物代谢[5-7]。CYP酶是一个多功能的酶系,在体内具有可抑制性和可诱导性。药物与药物相互作用能够在体内的所有过程(主要包括吸收、分布、代谢和排泄)中发生,其中在代谢过程中尤为明显,约占40%[8-9]。所以药物对于CYP酶的抑制作用研究是必不可少的,也是药物在临床前研究的重要一步,可为药物临床研究提供诱导效果与抑制效果的相关信息[10]。研究体外药物代谢与药物相互作用时最常采用肝微粒体法,该方法具有操作简单、重复性好等的特点[11]。

鉴于PT-46新颖的化学结构及良好的抗增值活性,本次实验采用肝微粒体法,运用Cocktail探针底物法研究PT-46对体外人肝微粒体中5种常见CYP酶的抑制作用,进而了解潜在的药物相互作用,旨在为后期该化合物的临床前研究或新药研发提供参考依据。

1 材 料

1.1 仪 器

X1型高速离心机,香港基因有限公司;数显恒温水浴锅,上海邦西仪器科技有限公司;FA805N型十万分之一电子天平,上海菁海仪器有限公司;DW-86L486型超低温保存箱,海尔集团公司;优普系列超纯水机,四川优普超纯科技有限公司;KH-600E型超声波清洗器,昆山禾创超声仪器有限公司;Xevo G2-XS型UPLC-四级杆串联飞行时间质谱仪,美国Waters公司。

1.2 药品与试剂

PT-46(纯度:>98%,批号:20201026),贵州医科大学药物化学重点实验室制备;5-羟基奥美拉唑、羟基甲苯磺丁脲、6β-羟基睾酮等对照品(批号:1-PSB-27-2、1-PSB-27-2、KIT0635,纯度≥98%),加拿大TRC公司;葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-P-DH,批号:20160725),北京索莱宝科技有限公司;磷酸盐缓冲液(PBS,浓度0.01 mol/L,pH7.4,批号:409L024),北京索莱宝科技有限公司;右美沙芬对照品(批号:01155029-75469A,纯度≥98%),上海泰坦科技股份有限公司,非那西丁对照品(批号:81105,纯度>98%),美国Sigma公司;奥美拉唑、甲苯磺丁脲、睾酮、对乙酰氨基酚、(+)-N-3-苄基香酚、奎尼丁、磺胺苯吡唑、酮康唑和α-萘黄酮等对照品(批号:100367-201305、100369-201307、L31J8T40939、SJ0711GA14、L27J9B64115、J09M6B1、A22M10L83645、100294-201203、B20083,纯度≥98%),上海源叶生物科技有限公司;右啡烷对照品(批号:FK-J1795,纯度>98%),上海樊克生物科技有限公司;葡萄糖-6-磷酸-二钠(G-6-P-Na2,批号:116B039)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸膦酸二钠(NADP-Na2,批号:718B0225)、葛根素对照品(内标,纯度:>98%,批号:528C021);乙腈、甲酸、甲醇均为色谱纯,柠檬酸钠、氯化镁等其余试剂均为实验室常用规格或分析纯,水为蒸馏水。

2 方 法

2.1 PT-46和内标溶液的制备

精密称取适量PT-46化合物,用甲醇溶解并定容,配制成质量浓度为5.0 mmol/L的贮备液,同法制得质量浓度为10 μmol/L内标溶液(含葛根素),放置在4 ℃下保存,备用。使用前,将PT-46贮备液用甲醇稀释,配制成质量浓度分别为5.0、1.5、0.5、0.15、0.05、0.015、0.005 mmol/L的溶液。

2.2 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)辅酶溶液的制备

依次称取200 mg G-6-P-Na2、200 mg NADP-Na2和133 mg 氯化镁,用水溶解,溶解后定容至10 mL,放置在-20 ℃下保存备用,记为A液。依次称取44 mg 1 000 U G-6-P-DH和柠檬酸钠,用水溶解,溶解后定容至25 mL,放置于-20 ℃下保存备用,记为B液。使用时,将AB两液按体积比5:1分别加入至孵育体系中。

2.3 混合探针底物溶液的制备

参照文献方法,精密称取4.32 mg奥美拉唑、7.557 mg非那西丁、12.3 mg右美沙芬、7.21 mg睾酮、13.5 mg甲苯黄丁脲,用甲醇溶解各底物并定容至10 mL作为探针底物贮备液。使用前,精密吸取上述探针底物的贮备液1.0 mL于5.0 mL量瓶中,氮气吹干,加入80 μL甲醇和20 μL DMSO溶解混合底物,最后再用0.1 mol/L PBS定容至5 mL。此时,混合探针底物溶液中奥美拉唑、非那西丁、甲苯黄丁脲、睾酮、右美沙芬的质量浓度分别为1000、1500、1000、500、250 μmol/L。

2.4 特异性抑制剂的制备

分别称取适量α-萘黄铜(CYP1A2)、磺胺苯吡唑(CYP2C9)、(+)-N-3-苄基香酚(CYP2C19)、奎尼丁(CYP2D6)、酮康唑(CYP3A4),用甲醇溶解稀释制成质量浓度均为1 mg/mL的单一贮备液。临用时,用甲醇分别配制为质量浓度为0.136、0.157、0.088、0.162、0.266 mg/mL备用。

2.5 肝微粒体体外孵育体系的建立

取人肝微粒体适量,用PBS稀释至0.5 g/L,孵育终体系为200 μL(100 mmol/L PBS)。取20 μL人肝微粒体于反应体系中,分别加入110 μL PBS、20 μL PT-46或特异性抑制剂、30 μL NADPH辅酶溶液(A液25 μL,B液5 μL),在冰浴中操作;迅速放入37 ℃水浴锅中,孵育3 min,加入20 μL混合探针底物溶液开始反应,反应时间为60 min,平行3组。确保孵育体系中溶解探针药物的DMSO含量不超过0.1%,甲醇含量不超过1%。反应结束后加入200 μL冰乙腈(含10 μmol/L)让反应终止,涡旋仪涡旋60 s,在13000 r/min下离心10 min,取上清液,氮气(N2)流吹干,残留物用200 μL甲醇进行复溶,再13000 r/min下离心10 min,取适量上清液进行超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)分析。

2.6 UPLC-MS/MS法检测

2.6.1 色谱与质谱条件色谱条件

AC QUITY UPLC©BEH C18(2.1 mm× 100 mm,1.8 μm);流动相:0.01%甲酸水-0.01%甲酸乙腈,梯度洗脱(见表1);柱温:40 ℃;流速:0.4 mL/min;进样量:2 μL。质谱条件:电喷雾电离源(ESI),正负离子灵敏度模式,数据采集范围质荷比(m/z)100~1200,毛细管电压为2.0 kV(正模式)、1.5 kV(负模式),脱溶剂的温度:400 ℃(正模式)、450 ℃(负模式),离子源温度:120 ℃(正模式)、110 ℃(负模式),碰撞气:氮气,雾化气:氩气,锥孔气流量:50 L/h,脱溶剂气流量:800 L/h。采用亮氨酸脑啡肽(1 ng/mL)和甲酸钠(0.5 mmol/L)分别进行质量轴的校正和质量数的实时校正。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Mobile phase gradient

表2 质谱条件Table 2 Mass spectrometer conditions

2.6.2 方法学考察

2.6.2.1 专属性

取人肝微粒孵育液,除不加探针药物和内标外,其余按“2.5”项操作,获得空白样品色谱图A;将一定浓度的代谢物标准溶液和内标溶液加入灭活的人肝微粒体孵育液,同上操作得色谱图B。

2.6.2.2 线性

分别取适量羟甲基苯磺丁脲、6β-羟基睾酮、5-羟基奥美拉唑、右啡烷、对乙酰氨基酚单一贮备液,用甲醇稀释成羟基甲苯磺丁脲质量浓度分别为0.15、0.30、0.61、1.22、2.44、4.88 μmol/L,6β-羟基睾酮质量浓度分别为3.67、7.34、14.68、29.34、58.68、117.37 μmol/L,5-羟基奥美拉唑质量浓度分别为0.10、0.19、0.38、0.77、1.54、3.09 μmol/L,右啡烷质量浓度分别为0.36、1.44、4.32、8.64、17.28、34.56 μmol/L,对乙酰氨基酚质量浓度分别为0.26、0.52、1.04、2.09、4.18、8.35 μmol/L的系列溶液,按“2.5”项下方法处理后进样进行测定,记录各峰面积。以上述成分质量浓度(x,μmol/L)为横坐标、与其内标峰面积之比(y)为纵坐标进行线性回归分析,结果见表3。

表3 鼠肝微粒体孵育体系中5种代谢物的线性Table 3 Linearity of 5 metabolites in mouse liver microsome incubation system

注:1.对乙酰氨基酚;2.右啡烷;3.6β-羟基睾酮;4.5-羟基奥美拉唑;5.葛根素;6.羟基甲苯磺丁脲图2 总离子流图Fig 2 Total ion chromatograms

2.6.2.3 准确度、基质效应、精密度以及稳定性

分别配制含有对乙酰氨基酚等5种代谢物的孵育体系的低、中、高3个浓度质量控制(QC)样品,每一浓度平行重复5个样品,按“2.5”项下方法处理样品后进样分析,考察精密度和准确度;取空白肝微粒体的孵育体系200 μL,置于2 mL Ep管内,按“2.5”项下方法处理,氮气流吹干后,各用质量浓度低、中、高的对乙酰氨基酚等5种代谢物对照品溶液200 μL复溶,每个浓度平行5份,计算各代谢物与内标峰面积比值(Ⅰ)与同样浓度的5种代谢物对照品溶液直接进样获得的峰面积(Ⅱ)的比值,考察基质效应。上述样品处理后室温放置12 h后进样分析,考察样品稳定性,结果见表4。

表4 5种代谢物在人肝微粒体孵育体系中的准确度、基质效应、精密度以及稳定性测定结果(n =5)Table 4 The results of accuracy,precision,matrix effect and stability of the five metabolites(n = 5)

2.7 体外孵育试验

体外孵育试验设置阳性对照组、空白组、试验组,每组各平行3组。按“2.5”项下方法制备孵育体系,其中,试验组的孵育体系中分别加入质量浓度分别为5.0、1.5、0.5、0.15、0.05、0.015、0.005 mmol/L的PT-46溶液使得孵育体系含PT-46的终浓度为 50.0、15.0、5.0、1.5、0.5、0.15、0.05 μmol/L,阳性对照组的孵育体系中分别加入“2.4”项下的α-萘黄铜(CYP1A2)、磺胺苯吡唑(CYP2C9)、(+)-N-3-苄基香酚(CYP2C19)、奎尼丁(CYP2D6)、酮康唑(CYP3A4)特异性抑制剂;空白组孵育体系中加入等体积的PBS缓冲液。测试CYP450特异性底物代谢产物的含量:CYP1A2(对乙酰氨基酚)、CYP2D6(右啡烷)、CYP2C19(5-羟基奥美拉唑)、CYP2C9(羟基甲苯磺丁脲)和 CYP3A4(6β-羟基睾酮)计算出的CYP1A2、2D6、2C19、2C9、3A4的IC50,用以评价化合物PT-46对CYP450 活性的抑制影响。

按“2.5”项下孵育体系进行孵育测定生成的各代谢产物浓度,将其与空白样品(未添加PT-46的样品)的代谢的产物浓度进行比较,可以得到酶剩余活性,之后以PT-46浓度为横坐标,酶剩余活性为纵坐标,运用 GraphPad Prism 5.0软件进行非线性拟合,作图并计算出IC50值。IC50=药物剩余浓度/药物浓度。

3 结 果

3.1 方法学考察

3.1.1 线性

结果表明,待测物对乙酰氨基酚、右啡烷、5-羟基奥美拉唑、羟基甲苯磺丁脲和内标葛根与空白肝微粒无干扰,专属性良好。

3.1.2 线性

5种代谢物的线性范围、线性方程如表3所示,大鼠肝微粒体孵育体系中待测物质的线性关系良好,各成分相关系数(r)均大于0.99。

3.1.3 准确度、基质效应、精密度以及稳定性

结果表明,5种检测物的准确度范围86.68%~107.42%,基质效应范围85.68%~109.88%,稳定性范围89.14%~99.65%以及精密度RSD小于10.0%,提示该方法准确、可靠、重现性好。

3.2 PT-46对ACYP450 5个亚型的抑制作用

通过PT-46在人肝微粒体体外孵育,得出PT-6对CYP450各亚型的抑制效果。把PT-46的浓度作为横坐标,酶剩余活性作为纵坐标,用Graphpad Prism 5.0软件进行非线性回归的分析,作图并且计算得到IC50值。酶活性与浓度的拟合图见图3,PT-46对人肝微粒体CYP450 5个亚型的IC50值见表5。阳性对照品IC50值的结果见表6。

图3 PT-46对人肝微粒体中CYP450酶5个亚型的抑制作用Fig 3 Inhibitory effects of PT-46 on five subtypes of CYP450 enzymes in human liver microsomes

表5 PT-46对人肝微粒体CYP450酶五个亚型的IC50值Table 5 IC50 values of PT-46 on five subtypes of human liver microsome CYP450 enzymes

表6 阳性对照对人肝微粒体CYP450酶五个亚型的IC50值,验收范围和是否通过Table 6 IC50 values,acceptable ranges and pass of five subtypes of human liver microsomal CYP450 enzymes in positive control

由图3、表5及表6可知,在测定IC50的实验中阳性对照组与CYP450的5个亚型的IC50值都在接受范围当中,由此可显示实验中的孵育体系有效。PT-46在给出浓度范围中对人肝微粒体中CYP1A2、CYP2D6、CYP3A4没有抑制作用,对CYP2C9、CYP2C19存在一定的抑制作用,其IC50分别为19.6、19.2 μmol/L。

4 结 论

受代谢酶的影响和控制,药物在体内的相互作用、药理活性以及代谢过程等方面存在明显差异。由药物代谢引起的药物-药物相互作用(Drug-Drug Interaction,DDI)发生率较高,导致严重 DDI 原因之一是药物对 CYP450 酶的抑制作用[12]。近年来,随着检测方法的特异性和灵敏度的不断提高,Cocktail探针药物法在各个研究领域中的应用越来越广泛。Cocktail探针药物法是指给予不同的剂量探针药物,测定每种探针药物代谢物生成率的方法[13-14]。优选化合物PT-46具有优异的体外抗肿瘤活性,研究其潜在的DDI效应是非常必要的。本研究对PT-46在肝微粒体中的代谢行为进行了初步探讨,采用Cocktail探针药物法评价了PT-46在人肝微粒体CYP酶亚系中的CYP3A4、2E1、2C19、2C9、1A2的抑制作用,所使用方法灵敏、快速。研究结果显示,PT-46对人肝微粒体中的2种亚型酶(CYP2C19和 CYP2C9)有着不同程度的抑制作用,并且呈浓度依赖性。该结果提示,在PT-46的后续研发中,应着重关注其与CYP2C19及CYP2C9的底物、诱导剂或者抑制剂同时使用,可能诱发DDI效应。

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