传染性海绵状脑病果蝇模型研究进展

王冬冬杨利峰赵德明周向梅

(中国农业大学动物医学院,北京 100193)

传染性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathies,TSEs),又称朊蛋白/朊病毒疾病(prion diseases,PrD)是一组能够感染人和动物的慢性、致死性、神经退行性传染病[1-2]。致病型朊蛋白(scrapie prion protein,PrPSc)是TSEs的致病因子,俗称朊病毒,由细胞型朊蛋白(cellular prion protein,PrPC)错误折叠形成[3]。在哺乳动物中,PrPC是高度保守的朊蛋白基因(PRNP)编码的一种糖蛋白,可能在神经系统、T细胞信号转导及核酸代谢等方面发挥一定作用;PrPSc富含β折叠,可抵抗蛋白酶水解,有很强的聚合倾向,最终聚合成淀粉样斑块造成大脑海绵状退化变性。目前PrPC转化为PrPSc的机制并不明确,成核-多聚化模型(nucleationpolymerization modle)和再折叠模型(refolding model)是描述转化机制的两种假说[1]。

果蝇(Drosophila)属于果蝇科果蝇属,是一类无脊椎动物。黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)是果蝇的一种,其遗传背景清晰、生命周期短、繁殖速度快且饲养成本低,已广泛用于生命科学研究[4]。果蝇基因组不含PRNP,是TSEs疾病研究的理想模型[5]。本文综述前人利用转基因果蝇对TSEs疾病的研究,以引起研究者的兴趣,促进果蝇模型的应用,减少和部分替代哺乳类实验动物的使用。

1 PrP转基因果蝇构建技术的发展

PrPSc与病毒和细菌等传统病原体不同,因其缺乏核酸为基础的基因组,不能利用PCR等核酸检测方法确定病原。蛋白质错误折叠循环扩增技术(PMCA)和实时振动诱导转换技术(RT-QuIC)可以在体外灵敏检测PrPSc,但无法检测其感染性[6-8]。通过接种哺乳类实验动物进行生物测定是目前检测PrPSc感染性的可靠方法,但整个测定过程繁琐、耗时、昂贵,并因动物生命晚期患有神经退行性疾病而越来越容易引起伦理争论[9-10]。果蝇遗传背景清晰简单,易于遗传修饰,利用分子生物学等技术可产生具有组织特异性的转基因表达,其神经系统相对简单,但具有一定的完整性和复杂性,可以完成多种复杂行为,常用于学习记忆、神经退行性疾病等神经科学研究[11-12]。通过不断探索和发展果蝇转基因技术,PrP转基因果蝇已初步应用于TSEs的研究,见表1。

表1 果蝇转基因方法比较Table 1 Comparison of transgenic methods for Drosophila

1.1 基于P转座子构建PrP转基因果蝇

P转座子(P-element)是果蝇中诱发杂种不育的转座子,研究者根据其特性已设计不同载体,用于基因中断、染色体工程、基因标签和基因表达/抑制等方面的研究[13]。Raeber等[14]利用P转座子介导法将叙利亚仓鼠朊蛋白(SHaPrP)基因导入果蝇胚系,在热休克启动子Hsp70控制下诱导表达SHaPrP,开启了应用果蝇进行TSEs疾病研究的先河,遗憾的是没有产成具有TSEs疾病表型的果蝇。后来Fernandezd等针对上述果蝇未形成TSTEs疾病表型开展研究,详见2.3。

1.2 基于UAS/GAL4系统构建转基因果蝇

UAS/GAL4系统原是存在于酵母中的基因表达调控系统,Brand等[15]最先将UAS/GAL4系统应用于果蝇。Deleault等[16]利用UAS/GAL系统将野生型或携带致病突变体PG14(14个八重复序列)的小鼠朊蛋白(MoPrP)基因导入果蝇胚系,获得了具有PrPSc的高转化率的转基因果蝇,但没有神经退化表现。Gavin等[17]利用UAS/GAL4系统获得了在胆碱能神经元特异性表达野生型和突变型(P101L)MoPrP的转基因果蝇,也是第一个具有神经退行性表型和构象变化的成功模型。

1.3 基于φC31整合酶系统构建转基因果蝇

Groth等[18]将噬菌体φC31整合酶系统应用于转基因果蝇的构建,该系统可介导其attB和attP识别位点之间的单向位点特异性重组。Murali等[19]利用φC31整合酶系统将野生型和突变体(P101L)MoPrP基因插入同一个attP位点,排除了插入于不同基因区域的影响。野生型MoPrP与突变体(P101L)转基因的表达水平相当,但P101L在胆碱能神经元的表达能导致细胞表面形成更大的点状沉积物,P101L转基因果蝇的运动和电生理缺陷都比野生型MoPrP转基因果蝇严重。

2 PrP转基因果蝇应用进展

果蝇已广泛应用于阿尔兹海默症、帕金森病等神经退行性疾病研究,并获得了相当多的专业知识。因此,应用PrP转基因果蝇研究哺乳动物TSEs疾病无明显障碍。

2.1 SHaPrP转基因果蝇中PrP的构象变化

Fernandez等[20]构建了SHaPrP转基因果蝇,分析了野生型PrP在其体内的动态变化:在幼龄果蝇中,PrP表现出正常PrPC的特性;在老年果蝇中,PrP错误折叠,获得PrPSc的生化和结构特性,并诱导脑神经元海绵状变性。由于这种PrP构象对蛋白酶仍然敏感,果蝇不会自发产生朊蛋白/朊病毒(prion),因此,Fernandez-Funez认为在果蝇中研究PrP是相对安全的[5]。

2.2 MoPrP/SHaPrP/RaPrP在转基因果蝇中的构象动力学差异

Fernandez等[21]构建了第一个表达兔朊蛋白(RaPrP)的转基因果蝇模型,并比较了与MoPrP和ShaPrP在构象动力学和诱导神经毒性等方面的差异:HaPrP可以诱导产生海绵状神经退行性变化,并形成高度聚集似羊痒病(scrapie)的错误折叠蛋白;RaPrP不诱导产生海绵状病理变化,也不会聚集形成错误折叠蛋白;MoPrP介于上述两者之间,诱导了轻微的神经退行性变化,并积累了少量的似羊痒病的错误折叠蛋白。

2.3 Hsp70与PrP的构象调控

Fernandez等[20]在SHaPrP转基因果蝇的脑神经元中过表达PrP和Hsp70,发现Hsp70直接与膜结构域中的PrP相互作用,可以防止异常蛋白积累和神经元丢失,解释了Raeber等[14]在1995年的研究中没能产生TSEs表型果蝇的原因。

2.4 PrP位点突变与致病性的影响

Park等[22]通过构建含有人/仓鼠3F4表位的MoPrP3F4转基因果蝇,发现MoPrP3F4可能是通过引起的氧化和自噬信号改变,增强了多聚谷氨酰胺毒性,造成了果蝇眼部病变。

Thackray等[23]构建了绵羊朊蛋白(OvPrP)转基因果蝇,幼虫暴露于羊痒病脑匀浆可加速OvPrP的表达,在成年果蝇中表现为运动能力显著降低。通过比较,A136R154Q171(ARQ)PrP转基因果蝇的寿命不受OvPrP的影响,而V136R154Q171(VRQ)PrP转基因果蝇的运动活性不受OvPrP的影响,这些表型的差异可能是OvPrP基因型差异造成[24]。Thackray等[25]还通过RNA-Seq转录组测序对OvPrP转基因果蝇进行分析,发现细胞周期活动异常、蛋白质合成抑制和线粒体功能改变,这与哺乳动物感染TSEs疾病相类似。

PrP的第159位天冬氨酸位点(D159)是在犬类动物中发现的特殊氨基酸位点,能保护犬类动物免受TSEs感染[26]。Sandez等[27]在MoPrP转基因果蝇上进行了N159D突变,证实了单一位点D159的替换足以防止PrP构象变化和致病性产生。

2.5 OvPrP转基因果蝇的传染性

Thackray等[28]证明,OvPrP转基因果蝇可以表现出哺乳动物PrPSc抗蛋白酶K(PK)的显著特征。小鼠接种了成年转基因果蝇脑匀浆后,最终可表现TSEs症状;转基因果蝇幼虫暴露于成年转基因果蝇脑匀浆,该幼虫在成年时也表现出等同于暴露于羊痒病脑匀浆的症状[29]。

3 结语

果蝇具有易饲养、生命周期短、繁殖能力强等诸多优点,已成为生命科学领域重要的模式生物,与之相关的研究也多次获得诺贝尔奖。基于P转座子、UAS/GAL4系统以及φC31整合酶系统等技术的优化、联合和改进,PrP转基因果蝇构建的效率和准确性得到巨大提升。表达哺乳动物PrP的转基因果蝇模型在揭示PrP生理学功能方面得到初步应用,推动了TSEs疾病的研究进程。近些年,CRISPR/Cas9基因编辑技术快速发展,已在果蝇上得到利用,可实现简便、特异、高效、经济的基因编辑,但未见文献报道用于TSEs疾病研究。展望未来,将果蝇CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于PrP转基因模型构建,将积极推进TSEs疾病的致病机制及防控探究,并减少或替代部分哺乳类实验动物的使用,符合实验动物福利伦理及3R原则。