自身免疫型卵巢早衰模型的研究

王海丹郭红玉马蔚蓉王琼严士海符蕊

(南京中医药大学附属医院江苏省中医院,南京 210029)

卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)是一种常见的妇科疾病,其特征是40岁以前出现卵巢功能衰退,伴随着闭经、血清高促性腺激素和低雌激素的症状[1]。它是早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)的终末阶段[2],对育龄妇女来说从身体和精神上都是伤害,不仅有围绝经期带来的痛苦,还会导致生育力下降或丧失,认知力下降,缺血性心脏病、骨质疏松、自身免疫性等疾病[3-4],身体和精神上的改变严重影响妇女及其家人的身心健康和生活质量。卵巢功能不全的原因很多,比如:自身免疫因素、遗传基因、环境和生活方式、心理压力、药物化学因素等[5-6]。自身免疫异常是比较重要的因素之一,约5%～30%的POF病例有自身免疫病因[7-8]。40多年前,卵巢组织就被证实是免疫系统的一个靶向器官[9]。但目前免疫性卵巢早衰的发病机制、有效的检测及治疗方法还在进一步探索之中。本文通过比较采用不同的造模时间和不同佐剂观察小鼠透明带多肽抗原诱导的免疫性卵巢早衰模型建立的相关因素,为高效高质量地建立免疫性卵巢早衰模型提供了一定的参考,为研究药物对免疫性卵巢早衰的作用机制提供一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

24只8周龄SPF级健康雄性A/J小鼠,体重18～22 g,购于江苏集萃药康生物科技有限公司【SCXK(苏)2019-0009】。24只8周龄SPF级健康雌性C57BL/6小鼠,体重18～22 g,购于斯贝福生物技术有限公司【SCXK(京)2019-0010】。将A/J雄鼠和C57BL/6雌鼠进行交配,繁育出B6AF1小鼠,7周龄时将所繁育的雌性小鼠查1周动情周期变化,筛选出具有正常动情周期的B6AF1小鼠50只,体重18～22 g。饲养于江苏省中医院实验动物中心【SYXK(苏)2017-0069】。实验小鼠在SPF级环境分笼饲养,温度为(20±2)℃,相对湿度维持在45%～65%,照明12 h更替,自由饮水饮食。所有操作均符合南京中医药大学附属医院实验动物伦理要求(审批号:2019DW-09-02)。

1.1.2 主要试剂与仪器

小鼠透明带多肽粉末:小鼠透明带3(ZP3)的第330～342个氨基酸序列(NSSSSQFQIHGPR),分析纯度96.91%(由上海吉尔生化有限公司生产,Catalog:271036);弗氏完全佐剂a(每毫升含有1 mg结核分枝杆菌TB)(sigma公司,Lot#SLBT1714);弗氏不完全佐剂a(sigma公司,批号:SLBT0114);弗氏完全佐剂b(每毫升含有5 mg结核分枝杆菌TB)(美国Chondrex公司,LOT:200010);弗氏不完全佐剂b(美国Chondrex公司,LOT:200079);E2试剂盒(北京华英生物技术研究所,批号:20201015);FSH试剂盒(北京华英生物技术研究所,批号:20201016);Tunel试剂盒(Servicebio公司,批号:G1501);Donkel试剂盒(Servicebio公司,批号:SA00013-5);DAPI(Servicebio公司,批号:G1012);全自动放免计数仪(西安 核仪器厂);NIKON ECLIPSE C1正置荧光显微镜(日本Nikon公司);Nikon DS-U3成像系统(日本Nikon公司);离心机(德国Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组及模型建立

将动情周期正常的B6AF1小鼠随机分为5组:正常组、模型A组、模型B组、模型C组、模型D组。将浓度为1 mmol/L的ZP3溶液与弗氏完全佐剂a和弗氏不完全佐剂a分别按1∶1体积比例配制成免疫试剂a和免疫强化试剂a,与弗氏完全佐剂b和弗氏不完全佐剂b分别按1∶1体积比例配制成免疫试剂b和免疫强化试剂b。造模均为尾根部皮下多点注射。正常组小鼠每次免疫时每只给予0.15 mL生理盐水。模型A组和模型B组分别单次注射0.15 mL免疫试剂a和免疫试剂b,2周后取材。模型C组和模型D组小鼠首次免疫时每只分别给予0.15 mL免疫试剂a和免疫试剂b,14 d后每只鼠分别给予0.15 mL免疫强化试剂a和免疫强化试剂b进行第2次免疫,28 d后进行第3次免疫,操作同第2次。第3次免疫后1周取材[10]。

1.2.2 取材及检测

每天定时用预吸有生理盐水的吸管轻轻插入小鼠阴道,取分泌物细胞,将有阴道分泌物细胞的液体滴入细胞板,在显微镜下观察细胞形态,记录小鼠动情周期变化[11]。实验末各组小鼠取血清,按试剂盒说明采用全自动放免计数仪检测小鼠血清E2、FSH水平。取单侧卵巢组织,HE染色观察卵巢各级卵泡、闭锁卵泡、黄体的变化。荧光tunel法检测卵巢细胞凋亡情况,按照以下步骤进行:石蜡切片脱蜡至水、蛋白酶K修复、破膜、室温平衡、加反应液TDT酶,dUTP、DAPI复染细胞核、封片、镜检拍照。荧光显微镜下观察DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色,试剂盒为FITC荧光素标记,阳性凋亡细胞核为绿色。免疫荧光法检测卵巢透明带的变化,按照以下步骤进行:石蜡切片脱蜡至水、抗原修复、画圈血清封闭、加一抗Donkel、DAPI复染细胞核、淬灭组织自发荧光、封片、镜检拍照。荧光显微镜下观察DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色,阳性表达为Donkel荧光素标记的绿光。

1.2.3 造模成功判定指标和鉴定方法

从动情周期变化、性激素水平、卵巢组织病理变化、卵巢颗粒细胞凋亡以及透明带变化来判定造模成功与否。如果同时出现动情周期紊乱;低雌激素高促卵泡刺激素水平;卵巢病理呈现初级、次级、成熟卵泡率变少,闭锁卵泡率上升;卵巢颗粒细胞凋亡率上升;透明带呈现亮色荧光圈;并且以上各项指标与正常组比较差异具有显著性的组别就判定为造模成功。

1.3 统计学分析

所有统计计算均用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析,所有数据皆以平均值±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验,P＜0.05为差异具有统计学意义。凋亡率统计采用Image J软件分析。

2 结果

2.1 小鼠动情周期变化

正常组和模型A组小鼠以动情前期、动情期、动情后期、动情间期的规律呈现5～6 d的1个循环。模型B组小鼠造模1周后呈现动情周期紊乱,但是各期还是呈现5～6 d的规律,只是动情后期和动情间期延长。模型C组和模型D组均在第3次免疫后呈现出明显的动情周期紊乱,80%的小鼠一直处于动情后期和动情间期,模型C组和模型D组比较差异无显著性(P＞0.05)(见图1)。

图1 小鼠动情周期细胞变化Note.a.Pre-estrus.Most of them are nucleated epithelial cells,but there are a few keratinized epithelial cells,no white blood cells.b.Estrous phase.All keratinocytes or a few epithelial cells occasionally.c.Late estrus.Nucleated epithelial cells,white blood cells and keratinocytes.d.Interestrous phase.Mostly white blood cells and a few epithelial cells and mucus.Figure 1 Changes of estrous cycle cells in mice

2.2 血清E2、FSH水平变化

与正常组相比,模型B组小鼠E2水平明显降低,FSH水平明显增加,与正常组比,差异具有显著性(P＜0.05)。模型C组和模型D组小鼠E2水平显著降低,FSH水平显著增加,与正常组比,差异具有显著性(P＜0.01)。模型A组小鼠血清E2、FSH水平与正常组比较差异无显著性(P＞0.05),模型C组和模型D组小鼠血清差异无显著性(P＞0.05)(见表1)。

表1 ZP3致卵巢早衰小鼠血清E2、FSH水平变化(±s,n=8)Table 1 Changes of serum E2 and FSH levels in mice with premature ovarian failure induced by ZP3(±s,n=8)

表1 ZP3致卵巢早衰小鼠血清E2、FSH水平变化(±s,n=8)Table 1 Changes of serum E2 and FSH levels in mice with premature ovarian failure induced by ZP3(±s,n=8)

注:与正常组比,*P＜0.05,**P＜0.01。(下表同)Note.Compared with normal group,*P＜0.05,**P＜0.01.(The same in the following tables)

组别Groups造模方式Modeling method E2(pg/mL) FSH(mIU/mL)正常组Normal group等量生理盐水NS 33.31±5.21 8.80±1.48模型A组Model A group 1次免疫+1 mg/mL TB Primary immunization+1 mg/mL TB 31.45±10.95 10.27±2.10模型B组Model B group 1次免疫+5 mg/mL TB Primary immunization+5 mg/mL TB 27.63±4.17* 13.29±4.51*模型C组Model C group 3次免疫+1 mg/mL TB Tertiary immunization+1 mg/mL TB 23.88±3.68** 15.31±4.28**模型D组Model D group 3次免疫+5 mg/mL TB Tertiary immunization+5 mg/mL TB 23.43±5.36** 12.68±2.13**

2.3 小鼠卵巢组织形态学的变化

正常组卵巢皮质区各级卵泡、黄体相间分布,比例正常。模型A组和B组初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡的比例有所下降,闭锁卵泡有上升趋势,但与正常组比较,初次级卵泡率、成熟卵泡率、闭锁卵泡率差异无显著性(P＞0.05)。模型C组和D组卵巢皮质多见黄体和闭锁卵泡,少见初级和次级卵泡,成熟卵泡基本未见或个别偶见,与正常组比较,模型C组和D组初次级卵泡率、成熟卵泡率、闭锁卵泡率差异有显著性(P＜0.01,P＜0.05),模型C组和D组之间比较差异无显著性(P＞0.05)(见图2,表2)。

表2 ZP3致卵巢早衰小鼠卵巢组织形态学变化(±s,n=8)Table 2 Morphological changes of ovarian tissue in mice with premature ovarian failure induced by ZP3(±s,n=8)

表2 ZP3致卵巢早衰小鼠卵巢组织形态学变化(±s,n=8)Table 2 Morphological changes of ovarian tissue in mice with premature ovarian failure induced by ZP3(±s,n=8)

组别Groups造模方式Modeling method初次级卵泡率(%)Primary and secondary follicles rate(%)成熟卵泡率(%)Mature follicles rate(%)闭锁卵泡率(%)Occluded follicles rate(%)正常组Normal group等量生理盐水NS 56.24±20.91 5.17±2.95 38.59±18.94模型A组Model A group 1次免疫+1 mg/mL TB Primary immunization+1 mg/mL TB 40.10±19.26 3.48±6.48 56.42±21.99模型B组Model B group 1次免疫+5 mg/mL TB Primary immunization+5 mg/mL TB 36.36±14.28 4.53±4.52 59.11±16.64模型C组Model C group 3次免疫+1 mg/mL TB Tertiary immunization+1 mg/mL TB 28.42±16.10* 1.39±2.50* 70.20±15.25**模型D组Model D group 3次免疫+5 mg/mL TB Tertiary immunization+5 mg/mL TB 32.20±10.11* 1.39±2.38* 66.40±10.58**

图2 小鼠卵巢组织形态学的变化Note.Complete histological structure of ovary.Local histological structure of ovary.Figure 2 Morphological changes of ovarian tissue in mice

2.4 小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的变化

正常组、模型A、B、C、D组卵巢颗粒细胞凋亡率分 别 为 8.15%、10.21%、11.18%、35.49%、36.89%。模型组C组、D组颗粒细胞凋亡率明显高于正常组,差异具有显著性(P＜0.05)。模型A组、B组颗粒细胞凋亡率有升高趋势,但是与正常组比较,差异无显著性(P＞0.05)(见图3,表3)。

图3 小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的变化Note.Apoptosis of ovarian granulosa cells was detected by fluorescence TUNEL.Under UV excitation,the DAPI-stained nuclei were blue,while the apoptotic nuclei were green.Figure 3 Changes in apoptosis of mouse ovarian granulosa cells

表3 ZP3致卵巢早衰小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的变化(±s,n=3)Table 3 Changes of apoptosis of ovarian granulosa cells in mice with premature ovarian failure induced by ZP3(±s,n=3)

表3 ZP3致卵巢早衰小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的变化(±s,n=3)Table 3 Changes of apoptosis of ovarian granulosa cells in mice with premature ovarian failure induced by ZP3(±s,n=3)

注:与正常组比,**P＜0.01。Note.Compared with normal group,**P＜0.01.

组别Groups 造模方式Modeling method 凋亡率(%)Apoptosis rate(%)正常组Normal group 等量生理盐水NS 8.15±0.99模型A组Model A group 1次免疫+1mg/mL TB Primary immunization+1mg/mL TB 10.21±1.08模型B组Model B group 1次免疫+5mg/mL TB Primary immunization+5mg/mL TB 11.18±2.15模型C组Model C group 3次免疫+1mg/mL TB Tertiary immunization+1mg/mL TB 35.49±1.93**模型D组Model D group 3次免疫+5mg/mL TB Tertiary immunization+5mg/mL TB 36.89±2.71**

2.5 小鼠卵巢透明带的变化

正常组卵巢未见透明带呈现很亮的绿光圈,模型各组卵巢可见明显的透明带绿色荧光,其中模型C组、D组透明带荧光更明显,颜色更亮(见图4)。

图4 小鼠卵巢组织透明带的变化Note.The zona pellucida of mice ovary was detected by immunofluorescence assay.The DAPI-stained nuclei were blue under UV excitation and the positive expression was green light labeled with Donkel luciferin.Figure 4 Changes of zona pellucida in mouse ovarian tissue

3 讨论

随着POF临床发病率的上升,寻求有效的POF治疗方案,尤其是针对其发病机制的靶向治疗,最终改善其卵巢功能,已成为亟待解决的难题[12-13]。而对于POF基础研究来说,建立一个有效的POF动物模型尤为重要。POF动物模型根据不同的因素有几种不同的造模方式[14-15],比如直接基因敲除,但是这类动物成本和饲养标准较高。胸腺切除也可导致卵巢早衰,但是手术复杂,在上个世纪有报道,但是近年来不常采用[16]。半乳糖造模周期很长[17],雷公藤和环磷酰胺等其他化疗药物造模虽耗时较短[18],造模药物易获,费用低但同时会带来早衰外的不良反应。

透明带蛋白ZP3被称作是初级精子受体,它是哺乳动物环绕在卵母细胞的外衣,能够影响卵泡各个发育阶段的透明带的合成,与卵母细胞成熟有直线相关的关系。用ZP3蛋白建立的POF动物模型与人类卵巢早衰具有相似的生殖内分泌和组织学变化,因此已成为近年来POF造模最重要及可靠的方法[19-20]。通过给予透明带多肽抗原,使动物体内产生抗透明带的抗体,从而建立免疫性卵巢早衰的模型。在建立的过程中,为了加强抗原的免疫效果会用弗氏完全佐剂进行免疫,采用ZP3多肽抗原作为造模剂是学者的共识,但在弗氏完全佐剂(结核分枝杆菌浓度不同)的选择和免疫干预时间上还不明确,所以本研究组针对不同的造模时间和不同佐剂进行了深入研究。研究发现单次以低浓度结核分枝杆菌的弗氏完全佐剂免疫动物,从血清性激素水平,卵巢病理改变、颗粒细胞的凋亡和透明带抗体变化这几个方面分析,检测结果不符合POF模型动物的特点。单次免疫高浓度弗氏完全佐剂后动物血清呈现低雌激素和高促性腺激素的变化,透明带抗体荧光也有出现,但是在卵巢组织病理学和颗粒细胞凋亡方面与正常组相比变化不明显。高浓度的佐剂虽然增强了免疫的反应,但是免疫细胞并未继续浸润和破坏颗粒细胞,使颗粒细胞层并未继续逐渐减少,所以未见组织病理学和颗粒细胞的改变。因此表明单次免疫不能完全达到POF动物模型的要求。由结果可见,在第1次ZP3免疫后继续加强免疫2次后,小鼠出现动情周期紊乱、高促性腺激素低雌激素、闭锁卵泡增多、透明带荧光显著、卵巢凋亡细胞增多的现象,这些结果完全符合POF模型动物的特征。在同样3次免疫的情况下,弗氏完全佐剂里结核分枝杆菌浓度的高低未见显著性的差异。

综上所述,ZP3诱导可以成功建立免疫型卵巢早衰模型,其中以3次免疫的成模效果更佳,为今后的研究者构建卵巢早衰模型提供一定的基础。