贻贝粘蛋白粘附性及抗氧化作用对大鼠溃疡性结肠炎的实验研究

刘朝阳吴琳琳田茂生张明全赵娜高记华

(1.河北中医学院,石家庄 050091;2.河北中医学院第一附属医院,石家庄 050011)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种慢性炎症性肠病,临床表现为持续或反复发作的腹泻、黏液脓血便等症状,具有病程长、易反复发作的特点[1-4]。UC的黏膜炎症从直肠开始,并以连续的方式向结肠近端延伸,且炎症通常局限于黏膜层[1]。研究显示,UC是一种肠道屏障疾病,其肠道屏障的功能障碍主要体现在紧密连接的表达变化,以及在炎症状态下,黏膜的黏附性下降[5]。且高浓度自由基水平和抗氧化能力低下为UC的主要病因之一,所以清除氧自由基、抑制过氧化可以预防并治疗溃疡性结肠炎[6]。目前临床多采用口服药物治疗UC,由于UC直肠炎症反应致大量肠液分泌及腹泻,一般外用药难以维持直肠给药的药物治疗浓度,且以局部治疗为主的直肠给药制剂匮乏,所以寻找一种粘附性高、具有良好抗氧化作用的直肠给药制剂是解决问题的有效途径。

贻贝粘蛋白(mussel adhesive protein,MAP)是海洋贻贝的足丝腺分泌并纯化的大分子蛋白,该蛋白与高等植物细胞壁中的伸展蛋白相似,是一种属于糖蛋白类型的粘液蛋白,具有超强的黏着性能[7]。MAP具有搭载高载量正电荷、多巴基团可氧化成膜以及良好疏水性等结构特点,可形成具有抗氧化能力的纳米级网状微观支架,从而抑制炎症,并促进多种细胞贴壁和爬行替代[8-9]。贻贝足丝蛋白中含有大量的L-3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA),该基团在碱性和过量甘氨酸作为还原剂的条件下,可参与发生氧化还原反应。研究显示,活性氧的代谢产物在UC的炎症发生发展过程中具有重要的作用[10],超氧阴离子自由基(O2-)是分子氧的单电子还原产物,具有较高的反应活性,极易衰变成活性氧单元[11]。氯化硝基四氮唑蓝(nitrotretrazolium blue chloride,NBT)还原反应常被用于清除O2-能力大小的检测,故NBT染色法可提示抗氧化作用。本研究旨在探讨MAP对溃疡性结肠炎模型大鼠肠黏膜的作用效果,从粘附性和抗氧化抗炎角度探究其相关的作用机制,从而为临床治疗UC提供科学依据和治疗新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

32只8周龄健康SPF级雄性SD大鼠,体重180～190 g,来自浙江维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(浙)2020-0002】,质量合格证号:20200730Aazz06190009。动物饲养于菲诺克生物科技(上海)有限公司实验动物中心SPF级屏障环境【SYXK(沪)2018-0023】,单笼饲养。饲养室温度(22±3)℃,湿度40%～70%,灯光12 h明暗交替。所有大鼠标准鼠食饲养,自由饮水。所有操作均符合菲诺克生物科技(上海)有限公司实验动物伦理学要求(伦理审批号:phenotek-sh012)。

1.1.2 主要试剂与仪器

葡聚糖硫酸钠(MP Biomedicals,SR01606);美沙拉秦栓(Dr.Falk Pharma GmbH,190329A);天然贻贝黏蛋白高聚物肛肠敷料(江阴贝瑞森制药有限公司,20200707-5);空白凝胶基质(江阴贝瑞森制药有限司,20200707-1);硝酸纤维素转印膜(Pall Corporation,T70720);固体氢氧化钾(上海麦克林生化科技有限公司,C10285994);甘氨酸(Sigma-Aldrich,SLBR4281V);贻贝粘蛋白(江阴贝瑞森生化技术有限公司,20012001-R);氯化硝基四氮唑蓝(上海前进试剂厂,190327);10%福尔马林中性固定液(南昌雨露实验器材有限公司,190803)

5%DSS溶液:称取葡聚糖硫酸钠(纯度:100%)80 g,加入1600 mL饮用水,搅拌至溶液澄清,常温贮存,每日配置。美沙拉嗪:美沙拉秦栓45℃水浴溶化,现用现配;甘氨酸-钾缓冲液(pH=10):称取75 g甘氨酸溶解于400 mL水中,用固体氢氧化钾(KOH)调节pH=10,加水定容至500 mL,配好后4℃保存;NBT染色液:称取9 mg NBT加15 mL甘氨酸-钾缓冲液溶解,混匀,临用现配;贻贝粘蛋白溶液:称取10 mg贻贝粘蛋白加10 mL生理盐水溶解,现用现配。

LeicaASP200型全自动脱水机(LEICA公司,德国);Leica RM2245型半自动切片机(LEICA公司,德国);Leica ST4040型全自动染色机(LEICA公司,德国);Olympus BX53型光学显微镜(Olympus,日本);SC180型图像分析系统(Olympus,日本);分析天平(常州奥豪斯仪器制造有限公司,中国);HH-1型数显恒温水浴锅(常州智博瑞仪器制造有限公司,中国);烘箱(上海跃进医疗器械有限公司,中国);D610型数码相机(尼康映像仪器销售有限公司,日本);培养皿;灌胃针;外科手术器械;1 mL注射器、2 mL注射器;比例尺;滤纸。

1.2 方法

1.2.1 实验分组

根据体重将32只清洁级雄性SD大鼠随机分为4组分别为正常组、模型组、美沙拉嗪组、贻贝粘蛋白组,每组8只。单笼饲养,每只动物在尾部标记单独的动物号,且每只笼具有笼具标签。

1.2.2 造模

模型组、美沙拉嗪组、贻贝粘蛋白组的动物连续7 d自由饮用5%(w/v)DSS溶液,制备UC模型。正常组动物同时予以普通饮用水作为对照。每日通过观测各组大鼠DAI评分、体重,监测模型进展情况。

1.2.3 给药

造模24 h大鼠经直肠途径局部治疗给药,模型组给予空白凝胶基质,美沙拉嗪组予美沙拉嗪,贻贝粘蛋白组给予天然贻贝黏蛋白高聚物肛肠敷料,正常组不做任何操作。给药前所有动物麻醉成功后,挤出直肠末端内大便,取仰卧位,以1 mL注射器连接灌胃针吸药物,每只大鼠给药300μL,缓慢注入直肠肠腔,灌胃针插入深度约8 cm,给药时左手捏紧肛门,给药完毕采取头低臀高位放回饲养笼,保持尾部朝上避免药物流出,早晚各1次,连续7 d。

1.2.4 取材

于实验第8天各组动物行CO2安乐处死后,沿大鼠肛周皮毛边缘起0.5 cm环形分离肛门,剥离肠管至盲肠根部,测量自然伸展状态下盲肠根部到肛门的结直肠长度,剥离多余的肌肉、脂肪、肠系膜等组织,纵剖全段结直肠,平铺肠管进行结直肠黏膜大体观察评分并拍照记录,生理盐水冲洗干净并用吸水纸拭干,分析天平称重,结肠组织以肛门为中心卷成“瑞士卷”形状,然后浸泡在10%福尔马林中性固定液中,以供病理组织学观察。

1.2.5 观察指标

(1)体重:实验期间每日同一时间称量所有动物体重并记录。

(2)疾病活动指数(DAI)评分:计算公式:DAI=(体重下降分数+大便性状分数+便血分数)/3,将每只动物置于无垫料的干净笼内自由排便,待粪便数目≥5,按照表1中标准[12-13],根据所有粪便颗粒硬度和颜色,综合评价大便性状和便血情况。

表1 DAI评分表Table 1 DAI Scores

(3)结直肠长度:测量各组大鼠取材后自然伸展状态下结直肠的长度。

(4)结直肠黏膜大体形态(CMDI)评分:将所有标本进行纵剖,平铺肠管,按表2标准[14-15]进行CMDI评分并拍照记录。

表2 CMDI评分表Table 2 CMDI scores

(5)结直肠重量与肠重比:所有标本称量湿重,计算肠重比:肠重比=肠重量/肠长度

(6)病理组织学观察:各组标本固定后,逐级乙醇脱水、透明、浸腊、包埋、切片,常规HE染色,光镜下观察组织病理学改变并按表3标准[16]进行评分记录。

表3 病理组织学评分标准Table 3 Pathological histology scoring criteria

(7)体外实验:NBT法检测MAP粘附性及抗氧化作用

取长度1 cm的大鼠直肠组织4段,纵剖铺平,黏膜面朝上用大头钉固定于滤纸片上,其中1段作为空白对照,其余3段分别浸泡于贻贝粘蛋白溶液(1 mg/mL)不同时间(10 s,1 min,10 min),取出后使用生理盐水冲洗表面3次,置于生理盐水湿盒,生理盐水湿润滤纸,将湿盒盖好后置于37℃烘箱中烘干15 h。取出后将滤纸更换成醋酸纤维素膜,将肠黏膜面朝下置于培养皿中,加入NBT染色液15 mL,使组织被NBT染色液均匀浸没,避光染色15 min观察各段组织染色情况并拍照记录。同法,空白组织浸泡生理盐水15 min。

1.3 统计学分析

各组数据采用SPSS 25.0与GraphPad Prism 8.0进行数据统计,所有数值采用平均值±标准差()表示,符合正态分布采用单因素方差分析,非正态分布采用秩和检验,以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 体重与DAI评分

正常组大鼠体重呈平稳上升趋势,模型组与正常组相比,于实验第5天出现体重明显下降,差异具有显著性(P＜0.05);与模型组相比,美沙拉嗪组和贻贝粘蛋白组自第5天起可见体重呈上升趋势,且差异具有显著性(P＜0.05,图1A)。

模型组第3天可见5只大鼠出现稀便;第4天所有动物均有稀便且活动减少;部分动物肉眼血便于第5天出现,个别反应迟钝;第6天部分大鼠出现皮毛不洁,体重下降;第7天模型组所有动物出现肉眼血便,个别出现精神萎靡、体重明显下降,模型组与正常组DAI评分差异具有显著性(P＜0.05);与模型组相比,美沙拉嗪组和贻贝粘蛋白组各项体征均减轻,DAI评分明显下降,差异具有显著性(P＜0.05);正常组大鼠无明显变化(图1B)。

图1 体重与DAI评分Note.A.Comparison of body weight.B.Comparison of DAI scores.Compared with the model group,*P＜0.05.(The same in the following figure)Figure 1 Body weight and DAI scores

2.2 结直肠解剖数据与黏膜大体形态观察

与正常组相比,模型组结直肠长度缩短、肠重比增加,差异具有显著性(P＜0.05);与模型组相比较,美沙拉嗪组和贻贝粘蛋白组结直肠长度增加、肠重比降低,差异具有显著性(P＜0.05,见图2A,2B)。

模型组结直肠黏膜形态观察见肠黏膜高度水肿、充血,部分黏膜粗糙、糜烂,可见多个大小不等溃疡形成,肠壁增厚(图2D),CMDI评分高于正常组(P＜0.05,图2C);与模型组相比,美沙拉嗪组和贻贝粘蛋白组可见结直肠黏膜水肿、充血减轻,偶见黏膜粗糙(图2D),CMDI评分均低于模型组,差异具有显著性(P＜0.05,图2C)。

图2 结直肠解剖数据与黏膜大体形态观察Note.A.Comparison of length of colorectum.B.Comparison of intestinal weight ratio.C.Comparison of CMDI scores.D.Observation of gross morphology of colorectal mucosa.Figure 2 Colorectal anatomical datas and observation of gross morphology of colorectal mucosa

2.3 病理组织学观察

正常组大鼠结直肠黏膜上皮完整,隐窝结构清晰,腺体排列规则,未见炎症细胞浸润,病理组织学评分为(0.13±0.35)分;模型组大鼠可见结直肠黏膜腺体结构被破坏,结肠隐窝肿胀变形,黏膜下组织大量炎细胞浸润,病理组织学评分为(3.38±0.74)分高于正常组,差异具有显著性(P＜0.05);美沙拉嗪组、贻贝粘蛋白组可见与模型组相似的病理变化,但病变程度较模型组减轻,病理组织学评分为美沙拉嗪组(2.38±0.74)分、贻贝粘蛋白组(2.13±0.64)分,均低于模型组(P＜0.05),且贻贝粘蛋白组可见黏膜上皮轻微至轻度再生(见图3)。

2.4 体外实验:NBT法检测MAP粘附性及抗氧化作用结果

实验可见空白对照组织无染色;与空白对照组织相比,浸泡10 s组织出现染蓝;与浸泡10 s组织相比,浸泡1 min组织可见染蓝加深;浸泡10 min组织可见较浸泡1 min组织更加明显的深蓝色(见图4)。

图4 MAP对直肠黏膜粘附及抗氧化作用观察Figure 4 Observations on the adhesion and antioxidant effects of MAP on rectal mucosa

3 讨论

据统计,我国UC的发病率呈逐年上升趋势,且多发于青壮年,并存在一定癌变的危险性[17-18]。在UC的发病过程中,氧化应激可导致肠道黏膜生物屏障被损坏,造成机体炎症性损伤[1,19]。MAP良好的粘附性可利于肠黏膜黏液层的重建、修护黏膜屏障,还能减少持续的炎性刺激黏膜上皮细胞、使屏障功能得以恢复[6,20-22],故在本研究中与模型组相比,贻贝粘蛋白组大鼠可见体重明显增加、稀便和便血症状明显改善,肠黏膜水肿及充血明显减轻。

生物体系中具有抗氧化能力的物质能有效抵御氧化应激的有害损伤,从而发挥抗炎作用[23]。在前期评价MAP抗氧化及清除自由基能力的研究显示[24],MAP对于DPPH·自由基的清除范围为4.59%～91.06%;MAP对ABTS·+的清除率为13.26%～93.77%;FRAP法中随着MAP浓度的变化其还原能力值范围为0.153FRAP值到1.825FRAP值。贻贝足丝蛋白中DOPA基团在碱性和过量甘氨酸作为还原剂的条件下,与NBT可氧化还原生成不溶性的蓝紫色结晶甲臜,于本研究体外实验中可见肠黏膜染色为不同程度蓝紫色,表明MAP粘附于大鼠肠黏膜可发生氧化还原反应,且呈现一定的时间相关性,由此可见,MAP能够有效清除超氧阴离子、抑制过氧化,具有良好的抗炎作用,故本研究病理组织学观察中可见贻贝粘蛋白组大鼠炎细胞浸润程度较模型组明显减轻,与前期研究所得MAP具有良好抗氧化活性能力的结论相符。

美沙拉嗪属氨基水杨酸类药物,作为一种非甾体类抗炎药,可通过抑制前列腺素的合成以及炎症介质白三烯的形成,产生抑制肠黏膜炎性反应的作用[25]。与美沙拉嗪组相比,贻贝粘蛋白组大鼠可见与其相似的体重增长趋势和DAI评分,且肠黏膜水肿、充血及炎细胞浸润程度均十分相近,可见MAP具有与美沙拉嗪对UC所相近的治疗作用。MAP良好的粘附性使其在直肠可维持药物的治疗浓度,且直肠黏膜为相当稳定的物理化学和酶环境,可避免部分肝首过效应,以直肠给药方式还可避免口服治疗的不良反应[26]。MAP具有粘附范围广、对粘附面的要求低等特点,临床中对促进慢性溃疡愈合及促进细胞的粘附等均具有良好效果[27-29],已被广泛应用于医学领域。

本研究通过建立UC大鼠模型,观察MAP对溃疡性结肠炎模型大鼠症状的改善作用,并取得了确切疗效,其作用机制为MAP具有良好粘附性和抗氧化能力,在直肠局部可维持药物的治疗浓度,不仅能修护肠黏膜屏障功能,还可以清除自由基减轻炎症,从而减轻肠黏膜屏障损伤,发挥修复肠黏膜的作用,为临床开发局部治疗的直肠给药制剂治疗UC提供新思路。