中国小型猪在生物医药领域的研究进展

陈雨荣安星兰张胜翟岩辉于浩代相鹏*李子义*

(1.吉林大学第一医院人类疾病动物模型国家地方联合工程实验室,长春 130021;2.吉林大学动物科学学院,长春 130062)

人类疾病动物模型是为阐明人类疾病的发生发展机制或建立预防、诊断和治疗方法而制作的具有人类疾病模拟表现的实验动物[1]。小型猪在生理生化指标、解剖结构、营养代谢、药物代谢和疾病发展等方面与人类相似,是理想的研究人类疾病的动物模型[2]。我国小型猪实验动物化研究开展于上世纪80年代,与欧美国家相比落后40多年。但我国小型猪资源丰富,一些地方小型猪种长期在封闭环境中进行繁育,形成了体型小、性成熟早、遗传性状稳定等优良特性,具有广阔的应用前景。我国实验动物化培育的小型猪品系包括:巴马小型猪、贵州小型猪、中国实验用小型猪、五指山小型猪、西藏小型猪、版纳微型猪、蕨麻小型猪等[3-4]。目前研究人员已建立了多种基于中国小型猪的人类疾病模型,但不同品系的小型猪在模拟不同的人类疾病上具有差异。为方便科研人员依照研究目的选择合适的小型猪进行疾病研究,本文将对中国小型猪资源现状及近年来建立的人类疾病模型进行综述,为利用中国小型猪研究人类疾病提供参考和指导。

1 中国小型猪的资源现状

在国家畜禽遗传资源委员会办公室近期公布的《国家畜禽遗传资源品种名录-猪志》中总共提及83个猪地方品种,其中属于小型猪有香猪、五指山猪、藏猪、滇南小耳猪等。中国小型猪具有体重小、抗逆性强、性成熟早、肉质好等特点,是发展生猪产业、培育新品种、保护遗传多样性、研究人类疾病的重要资源。由于中国小型猪种类较多,品种形成历史复杂,为了进一步明确中国小型猪的起源和进化关系,选择了12个代表性的各个地域的小型猪品种,以西南野猪、东北野猪、欧洲野猪为种的外类群,非洲疣猪为属的外类群。利用MEGA X软件,采用最小进化法基于线粒体DNA全基因组序列进行系统发生树的构建(见图1)[5-10]。结果表明:中国小型猪主要起源于西南野猪,而与东北野猪、欧洲野猪的进化距离较远。首先从西南野猪分化出来的是江浙地区的金华猪,另外一个是由两个亚类群组成的大类群,其中一支由云贵地区的版纳微型猪、从江香猪与滇南小耳猪组成的亚类群,另一支则是由巴马香猪、五指山猪、陆川猪、藏猪、碧湖猪、隆林猪、莱芜猪和荷包猪构成的最大类群。在最大的子类群中,云贵地区的小型猪无论从地理上还是遗传距离上都更接近西南野猪。推测中国的小型猪品种最初是从西南地区,尤其是云贵地区开始品种形成并逐渐向外扩散,可能由于人类迁移的不确定性等因素的影响,后期形成的小型猪种并没有形成地理依赖性聚类。

图1 基于线粒体全基因组构建的中国小型猪分子发生树Figure 1 Molecular phylogenetic trees of Chinese miniature pigs based on complete mitochondrial genome

2 中国小型猪在生物医药领域的研究

2.1 香猪

香猪包括从江香猪、环江香猪、剑白香猪、久仰香猪以及巴马香猪[11]。

2.1.1 巴马香猪(Bama xiang pig)

巴马香猪原产于广西巴马瑶族自治县,因其肉味鲜香得名“香猪”。巴马香猪体型较小,具有臀头黑、其余白的“两头乌”的毛色。成年母猪体重为(40.88±1.14)kg,公猪(27.13±2.06)kg,母猪72日龄,公猪110日龄性成熟,母猪多产,平均窝产仔数10.07头。巴马县巴马镇设有一巴马香猪国家级保种厂[11]。

广西巴马小型猪是1987年广西大学王爱德教授等[12-13]以巴马香猪为原始基础群,采用闭锁纯繁近交方式培育而成的小型猪封闭群品系。1994年定名为“广西巴马小型猪”,简称“巴马小型猪”。该品系成年母猪体重为40 kg左右,公猪35 kg左右[12-13]。

(1)在心血管系统疾病中的研究

巴马小型猪的部分血液生理指标、心脏解剖结构以及冠脉系统的分布与人类相似,目前已被广泛应用于心血管疾病的研究中[14]。

采用球囊封堵冠状动脉法可制备巴马小型猪急性心肌梗死模型,该方法对实验动物的创伤小,但容易引起心室颤动以及血栓[15]。开胸结扎冠状动脉可建立良好的巴马小型猪心肌缺血模型,该方法操作简单,但创伤大且死亡率较高[16]。

李艳君等[17]采用高脂高胆固醇饲料持续饲喂诱导巴马小型猪发生动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS),动脉粥样硬化指数可达3.8以上,且AS特征可稳定持续3个月以上。Fang等[18]采用CRISPR技术使载脂蛋白E基因(apolipoprotein E,ApoE)发生移码突变,获得ApoE-/-巴马小型猪,经高脂高糖饲料喂养6个月后模型猪出现严重的高胆固醇血症和动脉粥样硬化。研究人员认为该模型对AS的转化研究具有重要意义。

采用高脂高盐饲料连续诱导8周可建立巴马小型猪高血压模型,模型猪的收缩压和舒张压显著上升。该模型模拟了人类自然状态下高血压发生进程,对人类高血压病的预防和干预具有重要意义[19]。

Hai等[20]利用CRISPR技术敲除猪血管性血友病因子基因,建立了血管性血友病巴马小型猪模型,模型猪出现严重凝血功能障碍,与临床血友病患者症状较为相似。

(2)在内分泌系统疾病中的研究

此外,巴马小型猪可用于糖、脂代谢紊乱等相关代谢疾病的研究。研究人员也建立了巴马小型猪Ⅱ型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)模型。Li等[21]、相磊等[22]利用高脂高糖饲料诱导建立了巴马小型猪T2DM模型,实验组小型猪出现高胰岛素血症以及肥胖症状。而采用饮食诱导联合链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)的方法可成功建立疾病特征更为稳定的T2DM模型[23-24]。

(3)在消化系统疾病中的研究

巴马小型猪的肝质量、肝内血管及胆管分布、肝轮廓等方面与人类相似,是研究肝疾病的理想动物模型[25]。周忠信等[26]及廖锦元等[27]采用四氯化碳(CCl4)复合因素造模法成功制备出小型猪肝硬化模型,实验组小型猪丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶及总胆红素等水平逐渐升高,而球蛋白水平下降。并且,随造模时间的延长,模型猪由肝纤维化逐步发展为不可逆转的肝硬化,可用于研究肝炎、肝硬化的病理及生化指标的变化。

(4)在神经系统疾病中的研究

为建立巴马小型猪帕金森病(Parkinson disease,PD)模型,2015年赖良学团队利用CRISPR技术成功敲除巴马小型猪的磷酸酶及张力蛋白同源物诱导的蛋白激酶1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)和帕金森蛋白2基因(parkin 2,PARK2)基因,但7月龄小型猪未表现出如震颤、运动迟缓等帕金森病的典型症状[28]。随后,该团队以相同方法敲除巴马小型猪parkin、PINK1和DJ-1基因,但10月龄时小型猪表现正常[29]。Zhu等[30]采用CRISPR技术使α突触核蛋白(α-synuclein)基因发生错义突变,但3月龄小型猪未出现帕金森症状,仍需定期检查是否会出现疾病表型。

(5)在免疫系统疾病中的研究

α-1,3-半 乳 糖 基 转 移 酶 (α-1, 3-galactosyltransferase,GGTA1)、胞苷磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶 (cytidine monophosphate-Nacetylneuraminic acid hydroxylase,CMAH)和β-1,4 N-乙酸氨基半乳糖转移酶(β-1,4 Nacetylgalactosaminyltransferase 2,β4GalNT2)是3种引起异种移植排斥的主要抗原。潘登科团队利用CRISPR等技术分别建立了GTTAl/β4GalNT2双基因敲除[31],CAMH/GTTA1双基因敲除[32]以及表达hCD47的GTTA1/hCD47[33]巴马小型猪模型。模型猪的健康状况和繁殖能力正常,可为进一步降低异种器官移植急性排斥反应提供低免疫原性供体,并可用于探究hCD47基因在减弱受体巨噬细胞对异种移植各器官的排斥反应。2017年,杨璐菡团队利用CRISPR技术培育出了世界上首批不携带内源性逆转录病毒(porcine endogenous retroviruses,PERV)的巴马猪,解决了PERV可能感染人的问题,大大提高了一种移植的安全性[34]。2020年,该团队在PERV灭活巴马猪的基础上利用CRISPR技术敲除GGTA1,CMAH和β4GalNT2基因,并通过转座子敲入了9个降低异种排斥反应的人源基因(hCD46、hCD55、hCD59、hB2M、HLA-E、hCD47、hTHBD、hTFPI和hCD39),实现了异种移植的又一重大突破。体外实验中,模型猪细胞对人体体液免疫、细胞介导的损伤以及凝血功能失调相关的发病机制具有抵抗性[35]。

白介素受体γ链基因(interleukin-2 receptor gamma gene,IL2RG)和重组活化基因 1/2(recombination activating gene 1/2,RAG1/2)与淋巴细胞发育相关。RAG1/2敲除纯合猪表现出T、B细胞缺乏、脾发育不良等明显的严重联合免疫缺陷(severe combined immune deficiency,SCID)症状[36]。2014年,Huang等[37]利用类转录激活效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)技术成功敲除巴马小型猪RAG1/2基因,模型猪表现出免疫器官发育不全、无法进行V(D)J重组、缺乏成熟的B、T细胞等典型的SCID症状。吉林大学第一医院人类疾病动物模型国家地方联合工程实验室李子义、杨永广团队联合中科院动物所周琪团队,在国家重点研发项目和中科院先导项目等支持下,目前已获得RAG1和IL2RG双基因突变的(RAG1-/-/IL2Rγ-/Y)SCID猪,仔猪表现出明显的SCID症状。这些免疫缺陷模型对研究人类SCID相关疾病、评价干细胞移植的效率和安全性以及生产人源化动物模型具有重要意义(未发表)。

(6)在其他疾病中的研究

Zhang等[38]利用乙酰基亚硝基脲(ethylnitrosourea,ENU)诱导双氧化酶2(dual oxidase 2,DUOX2)基因发生纯合错义突变,建立了甲状腺功能减退巴马小型猪模型。模型猪出现严重的甲状腺功能减退、贫血和免疫缺陷。

敲除 4-羟基苯丙酮酸氧化酶(4-OH phenylpyruvate dioxygenase,4HPPD/HPD)可建立III型酪氨酸血症巴马小型猪模型。模型猪血液中酪氨酸含量以及尿液中4-羟基苯乳酸和4-羟基苯乙酸水平显著上升,符合人类III型酪氨酸血症的临床特征,可作为人类III型酪氨酸血症的理想模型[39]。

2.1.2 从江香猪(Congjiang xiang pig)

从江香猪(贵州香猪)主要分布在贵州从江、苗族自治区及广西环江县等地。该品系猪被毛全黑,成年体重(母猪)为(55.88±2.91)kg,性成熟较早,公猪30日龄即有精液排出,窝产仔数为(7.11±2.35)头[11]。

贵州小型猪是1985年贵州中医学院甘世祥教授等以贵州小型香猪为基础群,通过封闭培育、适度近交培育而成小型猪品系。1987年经专家鉴定后正式命名为“贵州小型猪”。该品系小型猪12月龄不超过25 kg[40]。

中国实验用小型猪是1985年中国农业大学的裴德智等以川黔交界山区小香猪为基础群,采用全同胞近交、负向选择方法培育而成的小型猪品系。该品系小型猪成年体重为35～40 kg[41]。

(1)在心血管系统疾病中的研究

采用开胸结扎法[42]、球囊封堵法[43]以及导丝介入栓塞法[44]均可建立贵州小型猪急性心肌梗死模型,研究人员认为相比开胸结扎法,球囊封堵法以及介入栓塞法对实验结果干扰小,与临床条件更为相近。

刘录山等[45]采用高脂高胆固醇饲喂法成功建立了贵州小型猪动脉粥样硬化模型。模型猪冠脉和腹主动脉管腔内出现明显与人类成熟斑块特点相似的凸起斑块,具有脂质坏死核心、大量泡沫细胞及炎性细胞等。

(2)在内分泌系统疾病中的研究

采用高脂高糖饲料诱导法[46-47]或STZ连续诱导法[48]可成功建立贵州小型猪T2DM模型,模型猪血糖升高,可用于T2DM的研究。另外,陈华等[49]研究发现与巴马小型猪和五指山小型猪相比,中国实验用小型猪对高脂饲料诱发T2DM相对不敏感,建模需要较长时间诱导,可作为糖尿病抗性品系。

(3)在消化系统疾病中的研究

Wang等[50]采用肝动脉灌注80%乙醇方法建立了贵州小型猪肝硬化和门脉高压模型。模型猪的疾病病理生理发展过程与人类相似,出现肝细胞变性坏死,肝发生明显的纤维化,可用于研究肝硬化的诊断及治疗方法。

采用外科手术方法可建立人工不完全性腭裂动物模型[51]以及牙槽嵴裂动物模型[52],这类唇腭裂模型效果稳定,对临床唇腭裂治疗研究具有重要意义。

(4)在运动系统疾病中的研究

猪膝关节解剖结构与人类相似,并且猪在运动过程中膝关节也存在大量屈曲动作。贵州小型猪还被用于建立双膝关节软骨缺损模型,研究人员分别采取移植骨髓有核细胞(bone marrow nucleated cells,BNCs)[53]或自体骨髓间充质干细胞[54]治疗软骨缺损,并发现两种方法对软骨缺损修复效果均良好,但BNCs的移植较为经济方便。

(5)在其他疾病中的研究

多囊蛋白1(polycystin-1,PDK1)和多囊蛋白2(polycystin-2,PDK2)基因突变可能导致常染色体显性遗传性多囊肾病。2013年,He等[55]建立了PDK2过表达转基因多囊肾病模型,但肾功能无明显变化。2015年,该团队利用锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)技术敲除PDK1基因,建立了多囊性肾病中国实验用小型猪模型。模型猪发生肝、肾囊肿,可用于研究多囊性肾病的发病机制[56]。

2.2 五指山猪(Wuzhishan pig)

五指山猪原产于海南中部黎族、苗族聚居的五指山地区,因体型矮小又得名“老鼠猪”。该猪被毛多为黑色或棕色,腹部和四肢内侧为白色,成年体重为30～35 kg,公猪5～6月龄,母猪6～7月龄初配,母猪初产(4.37±0.22)头,经产(6.58±0.31)头。1998年,海南省农业科学院畜牧兽医研究所对五指山猪进行了保种工作,并成立了五指山猪原猪场[11]。

五指山小型猪近交系是1989年中国农业科学院北京畜牧研究所冯书堂教授等以同窝的1公1母五指山猪通过“母配子”、“全同胞”的近交繁育方式培育而成的高度近交小型猪品系。该品系小型猪基因纯合度较高,毛色为上黑下白,成年猪体重为35 kg左右[57-58]。

实验用五指山小型猪封闭群是2007年由广东省实验动物检测所王希龙等从五指山地区引种108头五指山猪建立而成,该品系小型猪可分为花色系和白色系,12月龄体重为(27.72±6.56)kg[4]。

2.2.1 在心血管系统疾病中的研究

全基因组测序结果显示五指山小型猪与人类在冠心病相关基因上存在很多相似之处,在已检测的247个冠心病相关基因中仅缺失年龄相关性黄斑变性易感基因 2(age-related maculopathy susceptibility 2,ARMS2)基因和胆固醇酯转移蛋白(cholesteryl ester transfer protein,CETP)基因,并且五指山小型猪有1618个药物靶点与人类同源[59]。

采用微球分次灌注法或球囊封堵联合微球栓塞法可建立五指山小型猪心力衰竭模型,两种造模方法均具有闭胸、高成功率和重复性好等优点[60-61]。

采用高脂饮食诱导法可建立五指山小型猪高脂血症模型,连续诱导3～4月后小型猪血清中TC、HDL水平显著提高。该模型模拟了人类高脂血症发病过程,可用于研究血脂异常诱发心血管疾病的机制及预防治疗办法[62-63]。

延长高脂饮食诱导时间可建立五指山小型猪AS模型[64-65]。研究发现模型猪血浆和AS斑块中脂蛋白相关磷脂酶 A2(1ipoprotein-associated phospholipaseA2,Lp-PLA2)的表达明显升高,并且Lp-PLA2在血管炎症发生和AS斑块形成中发挥了关键作用[65]。

2.2.2 在内分泌系统疾病中的研究

Kong等[66]建立了肝特异性表达11β-羟类固醇脱氢酶1(11β-hydroxysteroid dehydrogenase 1,11β-HSD1)基因,胰岛β细胞特异性表达人胰岛淀粉多肽(human islet amyloid polypeptide,hIAPP)基因和DNA损伤诱导转录物3(C/EBP homologous protein,CHOP)基因的三基因共转五指山小型猪。转基因猪肝脏脂肪含量增加以及β细胞的凋亡,血糖并未升高。研究人员认为该模型具有T2DM发展潜力,可用于开发治疗糖尿病的新型药物。Li等[67]建立了过表达显性负性突变生长激素受体(growth hormone receptor,GHR)的转基因猪模型,转基因猪身材矮小,体重显著降低,血糖轻度升高,胰岛素/胰岛素样生长因子1通路紊乱。该模型可用于研究生长激素与癌症、糖尿病和寿命的关系方面。

2.2.3 在消化系统疾病中的研究

2008年,丁鳌等[68]通过牙周翻瓣、丝线结扎和接种牙龈卟啉单胞菌造成小型猪牙周感染,再结合高脂诱导,建立了五指山小型猪牙周感染与AS复合模型。模型猪牙周袋加深,牙龈出血指数增加,并且主动脉出现早期AS病变,可用于研究牙周炎与冠心病的关系。

2.2.4 在免疫系统疾病中的研究

潘登科团队先后采用免疫磁珠吸附[69]和TALEN技术[70]敲除α-1,3-半乳糖基转移酶(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)基因,成功制备了GGTA1基因缺失的五指山小型猪。GGTA1基因敲除后可降低免疫排斥反应,为异种器官移植研究的可靠供体。随后该团队建立了遗传稳定的胰岛特异表达LEA29Y转基因五指山小型猪模型。LEA29Y是一种能够高效抑制T细胞活性的新型人工融合蛋白。该转基因猪用于胰岛移植可以阻断T细胞激活的共刺激通路,降低胰岛移植术后人体内T细胞介导的免疫排斥反应,是胰岛异种移植的可靠供体[71]。戴一凡团队采用CRISPR技术分别建立了GGTA1/CMAH双基因敲除[72]、GGTA1/β4GalNT2双基因敲除[73]以及GGTA1/β4GalNT2/CMAH三基因敲除[74]五指山小型猪,模型猪表现较低的免疫原性。这些模型为异种器官移植的研究与利用提供了良好的研究材料。

2.2.5 在运动系统疾病中的研究

杨程等[75]通过外科手术方法建立了五指山小型猪膝关节软骨缺损模型,并发现骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和肋软骨细胞(costal chondrocytes,CCs)共培养构建组织工程软骨及共培养细胞修复五指山小型猪膝关节软骨缺损均具有较好的修复作用,为临床修复关节软骨缺损提供了理论依据和实验基础。

2.3 滇南小耳猪(Diannan small-ear pig)

滇南小耳猪主要分布于云南省,中心产区为西双版纳州一市两县境内,由长期近亲繁殖、选育形成。该猪被毛黑色,少数有六白特征,成年母猪体重为(49.69±0.27)kg,公猪(48.81±0.61)kg,母猪4月龄、公猪3月龄即可配种,初产母猪产仔数为8头,经产为9头左右。西双版纳州种猪场承担滇南小耳猪的保种工作[11]。

版纳微型猪属于滇南小耳猪。因其生长缓慢体型矮小等独特形状,1987年经盛志廉教授定名为版纳微型猪。该品系成年母猪体重为(43.3±1.0)kg,公猪(36.1±1.1)kg[76-77]。

版纳微型猪近交系是1980年由云南农业大学曾养志教授等以云南版纳拉祜族寨子中的滇南小耳猪为基础群,通过全同胞或亲子交两种高度近交方法培育而成。该品系近交程度高,成年猪体重平均为36kg[78-80]。

2.3.1 在代谢系统疾病中的研究

肖国华等[81]采用高脂高糖联合低剂量STZ诱导法建立了版纳微型猪T2DM模型。喂养12个月后,实验组小型猪空腹血糖值明显升高。随后实验发现,模型猪骨骼肌纤维普遍萎缩、肌纤维排列紊乱、糖原合成减少,肌肉素(Musclin)蛋白表达水平升高,因此推测肌肉素可能在T2DM的发生发展过程中发挥重要作用[82]。。

2.3.2 在免疫系统疾病中的研究

2013年,Xin等[83]选用版纳微型猪近交系小型猪,采用TALEN技术成功敲除小型猪GGTA1基因。该模型猪可用于异种器官移植研究。

2.3.3 在其他疾病中的研究

Zhou等[28]采用CRISPR技术成功敲除版纳微型猪的酪氨酸酶(tyrosinase,TRY)双等位基因,建立了白化病版纳微型猪模型。该猪皮肤、毛发以及眼睛中的黑色素全部消失,表现出典型的白化病特性,是研究人类白化病的发病机制以及治疗办法的良好模型。

2.4 西藏藏猪(Xizang Tibetan pig)

西藏藏猪主要分布于西藏的农区和半农牧区,是典型的高原猪种。全身被毛为黑灰色或淡黑色,少数为棕色,12月龄母猪体重为(22.98±0.65)kg,成年公猪(24.52±0.92)kg,4～6月龄性成熟,经产母猪产仔数为5.75头。西藏农牧学院目前建立了藏猪保种厂[4,11]。

西藏小型猪是2004年由南方医科大学顾为望教授等从西藏自治区林芝市工布江达县引进的42头藏猪为基础,进行封闭群管理建立而成,目前已完成风土驯化以及实验动物化研究。西藏小型猪全身黑色,体型矮小,是目前我国已知小型猪品系中体重最轻的品种。成年母猪体重为(28.06±3.92)kg,公猪(33.31±4.40)kg[84-85]。

2.4.1 在心血管系统疾病中的研究

与其他常见小型猪相比,西藏小型猪冠状动脉分支较少,是建立心梗模型的理想实验动物[86]。采用开胸结扎法[86]及球囊封堵法[87]均可建立西藏小型猪心肌梗死模型,病理切片结果显示梗死区域心肌结构失去完整性并且形成大量瘢痕组织。

陈民利团队采用高脂诱导和高脂高胆固醇诱导方法建立了藏猪胰岛素抵抗AS模型,模型猪主动脉脂质沉积和粥样硬化程度明显,并伴有胰岛素抵抗,可用于研究人类胰岛素抵抗和心血管疾病的疾病发生发展机制[88-90]。与五指山小型猪相比,在高脂环境下西藏小型猪的炎症反应程度较高而血脂较低,易形成向心性肥胖,脂肪多沉积在心脏、肾脏组织。研究人员认为西藏小型猪可能适合于研究中心肥胖型胰岛素抵抗的心血管疾病[91-92]。

赖良学团队先后利用ZFN技术和转基因克隆技术成功建立糖尿病和心血管病相关的重要靶点基因PPARγ基因敲除的杂合西藏小型猪模型[93],以及PPARγ过表达转基因西藏小型猪模型[94],该类模型可用于研究PPARγ基因在心血管系统中的功能及其对糖尿病和心血管病的影响,以及开发靶向PPARγ的新型胰岛素激动剂药物。

2.4.2 在神经系统疾病中的研究

赖良学团队利用转基因克隆技术成功培育出世界上首个转 httN208-105Q的亨廷顿舞蹈症(Huntington’s disease,HD)西藏小型猪模型,模型猪脑神经元发生凋亡,出现运动障碍及舞蹈样运动[95]。随后该团队利用相同方法建立了铜/锌超氧化物歧化酶(copper/zinc superoxide dismutase 1,SOD1)基因突变[96]以及反式激活反应-DNA结合蛋白(TAR DNA-binding protein 43,TDP-43)基因突变的西藏小型猪,模型猪表现出人肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)类似症状,如运动神经受损和肌肉萎缩等。

2.4.3 在运动系统疾病中的研究

手术切除西藏小型猪的左膝关节外侧半月板并离断其前交叉韧带可建立早期膝骨性关节炎(knee osteoarthritis,KOA)动物模型。模型猪术后四周的组织学检查结果最符合KOA软骨变化,可用于KOA早期MRI诊断以及早期治疗研究[97]。

2.4.4 在其他疾病中的研究

2017年,顾为望团队采用体细胞核移植技术成功建立了DKK1转基因西藏小型猪,pDKK1转基因在皮肤特异性表达,但并未出现无毛表型[98]。研究人员认为结果可能与转基因表达量不足以诱导无毛表型或DKK1在猪和小鼠中发挥不同作用有关(见表1)。

表1 中国小型猪在多种疾病研究中的应用Table 1 Application of Chinese miniature pigs in various diseases

3 展望

中国小型猪资源丰富,不同种群各具特色,可被广泛应用于人类疾病的研究中。目前已建立了涉及心血管疾病、糖尿病、肝病、神经退行性疾病、异种移植及免疫缺陷、口腔及骨骼疾病等多个系统的疾病模型,其中心血管疾病及糖尿病模型占较大比例。在已有的中国小型猪品系中,巴马小型猪的应用最为广泛。但中国小型猪的开发与实验动物化及其推广仍处于初级阶段,存在育成品系较少、保护力度不足和发展阻力较大等问题。并且由于用小型猪建立疾病模型的时间较短,一些模型虽具有表面效度及结构效度但缺乏预测效度,限制了小型猪疾病模型的推广应用及成果转化。

为进一步推动我国在以猪为模式动物的表型和遗传领域的研究,推动研究成果的转化应用,《国家重大科技基础设施建设中长期规划(2012-2030)》中明确指出“模式动物表型与遗传研究国家重大科技基础设施”为“十二五”期间优先安排内容。据报道,中国农业大学负责猪表型与遗传研究设施建设。该项目总投资7.5914亿元,于2019年动工,预计将在2023实现开放共享。该设施计划对猪的培育、表型和遗传分析进行一体化研究,建成世界上首个以猪为模式动物的大型综合研究设施,确立我国以猪为模式动物开展生命研究的国际领先地位。由中国农业大学主导的国际模式猪计划(Pig Model Project,PMP)是该项目的重要内容,计划对猪所有基因进行敲除,建立完整的基因敲除猪表型品系,促进国内外合作,实现猪的模式动物化。

总之,通过加大科技投资力度,建立多种技术平台,利用基因编辑、体细胞核移植等新兴技术并结合我国小型猪品系的特点和优势,建立更多符合生物医药研究要求的小型猪新品系及疾病模型,促进资源开放共享与交流合作,将有助于提高小型猪资源的利用价值,为基因功能、人类疾病、异种器官移植研究以及动物遗传育种提供良好的实验材料。