碳纸负载碳酸氢镍纳米颗粒的无酶葡萄糖电化学传感器

李恳恳 王松磊 罗瑞明 马 亮 刘 丽 魏培媛 张 也

(宁夏大学食品与葡萄酒学院，银川 750021)

0 引 言

作为在人体内被直接吸收利用的单糖，葡萄糖是人体新陈代谢的重要物质，但对于婴幼儿来讲，长期食用含糖食品会导致肥胖症、食欲降低及龋齿等健康问题[1]。由于国内不少厂家为提升奶制品的口感而使用葡萄糖进行掺杂，因此对奶制品中葡萄糖的检测十分必要。目前葡萄糖的检测方法主要有比色法[2]、气相色谱法[3]、荧光检测法[4]和电化学传感器法[5]等，其中比色法和气相色谱法在检测时不仅非常耗时，且样品预处理过程烦琐[6⁃7]，而荧光检测法易受到其他物质的干扰[8]。近年来，电化学传感器法由于具有优异的灵敏度、快速的响应时间和良好的稳定性等优点被人们认为是检测葡萄糖的重要方法之一[9⁃10]。目前用于葡萄糖检测的传感器以酶类传感器为主[11⁃12]，虽然该类传感器对葡萄糖的选择性极高，但其进一步的应用因为高成本及天然酶的不稳定性而遇到了重重阻碍[13⁃14]。

为解决这些问题，无酶葡萄糖电化学传感器因具有长期稳定性及可重复性等优点引起人们的极大关注[15]，但是无酶葡萄糖传感器技术的发展受到阳极材料制备过程复杂及电极的电化学活性界面难控制的影响[16⁃17]。近年来，学者们发现过渡金属的纳米材料是制备葡萄糖电化学传感器最合适的材料之一[18⁃19]。据报道，镍基材料通过氧化还原对Ni3+/Ni2+的相互转化进行电催化循环，因此基于镍的葡萄糖传感器比其他过渡金属基传感器展现出更高的灵敏度[20⁃21]。Wang等[22]的研究表明，Ni3+与 Ni2+的比例增加会使电极具有更高的电催化活性，但是其在富氧环境下耐久性不足的缺点限制了在实际中的应用。自支撑电极是目前一种新型的电极类型，该类电极较化学修饰电极相比具有更高的稳定性和催化活性[23]，而导电性基底碳纸具有三维结构和良好的稳定性[24]，是制备自支撑电极的最佳选择材料。

针对葡萄糖无酶传感器快速检测需求，我们采用一步水热法制备基于碳纸负载的过渡金属碳酸盐材料自支撑电极，构建出无酶葡萄糖电化学传感器，该传感器具有快速的响应时间和较高的灵敏度，可以实现对乳制品中葡萄糖的有效检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

所用仪器包括：CHI⁃660E型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)、TGL⁃16M型高速离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)、FCH⁃202型数显加热磁力搅拌器(弗鲁克有限公司)、Smart Lab X射线衍射仪(日本理学株式会社)、SU4800场发射扫描电子显微镜(日本日立公司)。

Ni(NO3)2·6H2O、尿素、丙酮、无水乙醇、乙二醇和葡萄糖购自国药集团化学试剂有限公司。NaCl、NaOH、抗坏血酸(AA)、乳糖(Lac)、L⁃半胱氨酸(L⁃Cys)和果糖(Fru)购自上海瑞恩有限公司。碳纸购自苏州晟尔诺科技有限公司。乳制品样品均购自某超市。所用试剂均为分析纯，所用水为去离子水。

1.2 实验过程

1.2.1 碳纸预处理

将碳纸的尺寸裁剪为2cm×3 cm的大小，依次用丙酮、无水乙醇和去离子水超声清洗10 min，置于60℃真空干燥箱内干燥8 h，冷却至室温后备用。

1.2.2 碳纸负载镍基材料电极的制备

采用简便的一步水热法制备。首先称取4 mmol Ni(NO3)2·6H2O和15 mmol尿素于烧杯中，加入由1.5 mL超纯水和13.5 mL乙二醇配成的水热反应液，随后将混合溶液持续搅拌20 min使其混合均匀。配制好的前驱体溶液转移至水热反应釜中，将上一步处理好的碳纸倚靠于反应釜的聚四氟乙烯内胆中，密封后放入160℃的烘箱中连续反应6 h，反应结束后自然冷却至室温。随后将碳纸取出，依次用无水乙醇和超纯水各洗涤数次至无颗粒脱落，反应釜内剩余溶液中的沉淀经离心干燥后用于后续表征。最后将制备的工作电极置于60℃真空干燥箱内干燥8 h，即得到生长于碳纸上的Ni(HCO3)2纳米颗粒(NPs)，记为Ni(HCO3)2NPs/CP。

1.2.3 材料表征

采用粉末X射线衍射(XRD)对样品进行物相分析。测试条件：工作电压45 kV、电流200 mA、Cu靶Kα辐射源、波长0.154 18 nm、扫描范围5°～85°。样品的形貌采用扫描电子显微镜(SEM)进行分析，加速电压15 kV。

1.2.4 乳制品样品的制备

乳制品样品的制备参考GB/T 5009.8⁃2016[25]中的样品处理过程并进行了改进，具体过程如下：

固体样品的制备：称取粉碎后的试样5 g于100 mL容量瓶中，加水50 mL溶解并缓慢加入乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液各5 mL，定容至刻度，超声30 min后用干燥滤纸过滤，滤液用0.22 μm微孔滤膜过滤后即得到处理好的样品。

液体样品的制备：取试样200 mL于旋转蒸发仪中进行除水处理，随后取试样2 g于50 mL容量瓶中，定容至刻度，充分摇匀后用干燥滤纸过滤，滤液用0.22 μm微孔滤膜过滤后即得到处理好的样品。

1.2.5 电化学性能测试

使用CHI⁃660E型电化学工作站在室温下进行所有的电化学测试，采用常规的三电极体系，以多用铂片电极夹将制备好的Ni(HCO3)2NPs/CP固定作为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极。所用的电化学测试方法主要包括循环伏安(CV)法和时间-电流响应法，支持电解质为0.1 mol·L-1NaOH溶液，扫描电位窗口范围为0～0.7 V(vs SCE)，扫描速率(v)为100 mV·s-1。此外，在所有测试中的工作电极几何面积控制在0.25 cm2。

2 结果与讨论

2.1 材料的形貌表征

以SEM观察样品的微观形貌特征，结果如图1所示。图1a为碳纸基底的SEM图，可看出碳纸基底由直径约为10 μm的碳纤维构成，其表面光滑且沟槽略浅。图1b、1c为Ni(HCO3)2NPs/CP的低倍SEM图像，可看出在碳纤维上均匀生长出Ni(HCO3)2NPs并形成致密的结构，有利于电催化氧化时对葡萄糖分子的吸附。图1d的高倍SEM图像清晰地展示出Ni(HCO3)2呈现多面体结构，其分散性一般且呈聚集状态，粒径约为50 nm，紧密相连，在增加了表面积的同时提供了更多的催化活性位点。

图1 (a)裸碳纸和(b～d)Ni(HCO3)2NPs/CP的SEM图Fig.1 SEM images of(a)bare carbon paper and(b⁃d)Ni(HCO3)2NPs/CP

XRD能够对材料的组成、晶体结构和结晶度等进行解释说明。Ni(HCO3)2NPs/CP的XRD图如图2所示。从图中可以看出衍射峰分别位于2θ=14.8°、25.9°、33.6°、37.0°、40.1°、43.0°、45.7°、55.7°和62.5°处，与 Ni(HCO3)2标准卡片(PDF No.15⁃0782)基本吻合，分别对应 Ni(HCO3)2的(110)、(211)、(310)、(222)、(321)、(400)、(330)、(510)和(440)晶面，说明所制备的材料为Ni(HCO3)2晶体，其峰型尖锐则表明结晶性能良好。另外，图中没有杂相衍射峰，说明在水热反应的高温高压环境下，尿素完全分解并与镍源反应生成的产物晶型单一、纯度较高。

图2 Ni(HCO3)2NPs/CP的XRD图Fig.2 XRD pattern of Ni(HCO3)2NPs/CP

2.2 Ni(HCO3)2NPs的合成及检测原理

Ni(HCO3)2NPs通过一步水热法合成，其在水热过程中的形成机理可推断(图3)为尿素在水热过程中会分解为NH3·H2O和CO2，这2种物质会慢慢水合形成 OH-、CO32-、HCO3-离子，Ni2+与 HCO3-反应生成Ni(HCO3)2。具体的反应式如下：

在含葡萄糖的碱性溶液中，电极表面的Ni(HCO3)2NPs与溶液中OH-结合生成NiOOH，含有高价镍的NiOOH将葡萄糖氧化成葡萄糖酸内酯，导致加入葡萄糖之后的氧化峰电流密度增大，同时生成Ni(OH)2，Ni(OH)2又与OH-结合生成NiOOH，保证了催化氧化反应的不间断进行。电极表面发生的可能电化学反应如图3所示。

图3 Ni(HCO3)2NPs水热过程形成机理及其对葡萄糖的传感原理Fig.3 Formation mechanism in hydrothermal process and sensing principle for glucose of Ni(HCO3)2NPs

2.3 Ni(HCO3)2NPs/CP自支撑电极对葡萄糖的传感性能

2.3.1 Ni(HCO3)2NPs/CP对葡萄糖的CV研究

采用循环伏安法来评估Ni(HCO3)2NPs/CP的电催化性能。图4a展示了裸碳纸在含5 mmol·L-1葡萄糖的0.1 mol·L-1NaOH溶液中的电化学行为，裸碳纸在NaOH溶液中含有/不含有葡萄糖时均没有明显的氧化还原峰出现，说明裸碳纸在葡萄糖电化学氧化过程中表现相对不活跃，不能将其直接应用于对葡萄糖的检测。图4b表明当其表面负载Ni(HCO3)2NPs时，可观察到一对明显的氧化还原峰，同时峰值电流的显著增大则说明Ni(HCO3)2NPs对葡萄糖具有良好的电化学响应。制备的Ni(HCO3)2NPs/CP展现的优异电化学性能可归功于以下几个方面：第一，过渡金属碳酸盐与导电材料能够产生协同作用提高其导电性，同时还能稳定活性物质结构，此外，碳纸能够有效抑制晶体的过度生长从而获得尺寸为纳米级别的过渡金属碳酸盐颗粒；第二，Ni(HCO3)2NPs/CP的纳米结构提供了更大的比表面积和更多的活性位点，利于催化氧化反应的进行；第三，NiOOH与葡萄糖反应生成的Ni(OH)2可在电极表面再次反应转变为NiOOH，因此Ni(HCO3)2修饰电极检测葡萄糖时氧化峰电流增大。

图4 样品在无葡萄糖和含有5 mmol·L-1葡萄糖的0.1 mol·L-1NaOH溶液中的CV曲线Fig.4 CV curves of the samples in 0.1 mol·L-1NaOH solution without glucose and containing 5 mmol·L-1glucose

为研究Ni(HCO3)2NPs/CP的电催化动力学控制过程[26]，记录其在10～100 mV·s-1不同扫描速率下的CV曲线，结果如图5a所示。图中显示随着扫描速率的增加，峰值电流不断增大，阳极峰电位正向偏移，阴极峰电位负向偏移，这是因为当电极表面发生氧化还原反应时，电化学反应和电解质扩散相互制约，当扫描速率过快时电化学反应发生快，扩散速度相对较慢，限制了电化学反应，从而导致强极化作用，使电位出现偏移，表明在葡萄糖的电化学氧化过程中存在着动力学限制[27]。图5b表明峰值电流与扫描速率的平方根成良好的线性关系，氧化峰电流线性方程为y=1.065 2x-0.917 6(R2=0.999)，还原峰电流线性方程为y=-0.822 9x+0.884 3(R2=0.998)，说明Ni(HCO3)2NPs/CP上的葡萄糖电化学氧化过程是一个典型的扩散控制过程[28]。

图5 (a)Ni(HCO3)2NPs/CP在含有5 mmol·L-1葡萄糖的0.1 mol·L-1NaOH溶液中的不同扫速下的CV曲线;(b)峰值电流与扫速平方根的校准曲线Fig.5 (a)CV curves of Ni(HCO3)2NPs/CP in 0.1 mol·L-1NaOH solution containing 5 mmol·L-1glucose at different scan rates;(b)Calibration curve of peak current and square root of scan rate

2.3.2 电解质溶液pH值的优化

NiOOH在葡萄糖电化学催化氧化过程中起关键作用，而OH-则参与生成NiOOH，为此研究了pH值对Ni(HCO3)2NPs/CP电催化氧化葡萄糖的影响。图6a展示了在5 mmol·L-1葡萄糖中Ni(HCO3)2NPs/CP的电流响应强度与pH值的关系，可明显看到随pH值的增加，氧化峰向低电势方向移动，还原峰向高电势方向移动。图6b揭示了阳极峰值电势与pH值之间的线性关系，回归方程为y=-0.109x+1.913(R2=0.996)。在典型的Nernst过程中，转移的质子数与电子数相等，斜率为-0.059 V[19,29]。但是，此修饰电极的斜率为-0.109 V，表明在葡萄糖的电化学氧化过程中转移的质子数与电子数之间存在差异，即表明在电催化氧化葡萄糖过程中，Ni(HCO3)2NPs/CP表面同时发生多个电化学反应，也进一步验证了上述电催化机理。当pH>13时，峰值电流的突然增大表明有大量的氧气逸出，发生析氧反应，因此所有的电化学测试均在pH=13下进行。

图6 (a)Ni(HCO3)2NPs/CP在含有5 mmol·L-1葡萄糖的不同pH值NaOH溶液中的CV曲线;(b)Ni(HCO3)2NPs/CP的CV曲线的阳极电位与pH值之间的线性关系Fig.6 (a)CV curves of Ni(HCO3)2NPs/CP in NaOH solutions containing 5 mmol·L-1glucose at different pH values;(b)Linear relationship between anode potential of CV curve of Ni(HCO3)2NPs/CP and pH value

2.3.3 Ni(HCO3)2NPs/CP对葡萄糖的电流响应

采用时间-电流响应曲线评估所制传感器对葡萄糖检测的灵敏度和线性范围。首先考察了外加电位的影响，每间隔100 s连续添加葡萄糖对0.45、0.50和0.55 V三个电位进行测试，最终获得最佳电位，结果如图7a所示。可看出电流密度随所添葡萄糖浓度的增加而变化，与此同时，随着工作电位的增加，电流增量先增大后减小，0.50 V时增量达到最大，因此选择0.50 V为最佳工作电位。

在最佳电位下，测定了Ni(HCO3)2NPs/CP随葡萄糖浓度不断变化的时间-电流响应曲线(图7b)，图7b插图部分展示了葡萄糖在较低浓度范围内(2.95～8.45 μmol·L-1)的测试结果。通过记录相邻浓度间稳态电流的阶跃时间，研究了Ni(HCO3)2NPs/CP对葡萄糖的响应时间。如图7c所示，电流密度的阶跃只需3.1 s，表明Ni(HCO3)2NPs/CP对葡萄糖具有快速的响应时间。图7d为葡萄糖浓度与电流密度之间的校正曲线，在葡萄糖浓度为2.95～1.02 mmol·L-1时，线性方程为y=0.935 6x+0.060 9，相关系数R2=0.996，由拟合曲线计算出该传感器的检测灵敏度为935 μA·L·mmol-1·cm-2。此外，根据方程 LOD=3σ/k[30]可得检出限(LOD)为 0.98 μmol·L-1(S/N=3)。以上结果表明，Ni(HCO3)2NPs/CP修饰电极对葡萄糖的检测具有良好的响应，与已报道的同类型传感器相比(表1)，表现出较高的灵敏度和较低的检出限，进一步表明该电极材料作为葡萄糖无酶传感器的优势。

表1 Ni(HCO3)2NPs/CP与已报道的葡萄糖检测电极的性能对比Table 1 Comparison of performance of Ni(HCO3)2NPs/CP and reported glucose detection electrode

图7 Ni(HCO3)2NPs/CP对葡萄糖的检测:(a)在不同电位下的电流响应,(b)在0.50 V下连续添加葡萄糖的电流响应(插图:900～1 400 s范围),(c)响应时间图,(d)葡萄糖浓度与电流密度的线性关系Fig.7 Ni(HCO3)2NPs/CP for glucose detection:(a)responses at different potentials,(b)current response of Ni(HCO3)2NPs/CP with continuous addition of glucose at 0.50 V(Inset:in the range of 900⁃1 400 s),(c)response time diagram,(d)linear relationship between glucose concentration and current density

2.3.4 Ni(HCO3)2NPs/CP修饰电极的稳定性能和抗干扰性能

在无酶葡萄糖传感器的实际应用中，其稳定性能和抗干扰性能至关重要。为考察修饰电极对葡萄糖响应的稳定性，对Ni(HCO3)2NPs/CP修饰电极进行100次循环扫描，结果表明随循环次数的增加，电流逐渐趋于稳定，将第20次和第80次的CV曲线进行对比，结果如图8a所示，可清晰看出2次扫描的氧化峰峰电流分别为7.11和7.42 mA·cm-2，相对变化率为4.2%，而还原峰峰电流的相对变化率几乎为0，说明所制电极具有良好的稳定性能。对于不同批次电极的重现性及同一电极放置一段时间后的稳定性，考察了7支传感器在相同条件下对葡萄糖的响应电流强度及同一传感器放置不同天数下对葡萄糖的响应电流强度，结果如图8b所示。可以看出7支不同传感器之间的电流强度值相差不大，通过计算得出相对标准偏差(RSD)为3.24%。此外，在相同的测试环境下，连续7 d考察该电极对等量葡萄糖的响应电流强度值，由图8c可看出Ni(HCO3)2NPs/CP电极在储存7 d后响应电流强度值下降较小，相对于第1天仍保持约89%的响应电流强度。以上结果均表明Ni(HCO3)2NPs/CP电极在无酶催化检测葡萄糖时具有较好的重现性和稳定性。通过时间-电流法对Lac、Fru、AA、NaCl和L⁃Cys等一些常见干扰物进行测试评估，结果如图8d所示。添加葡萄糖时获得明显的电流响应，而Lac、Fru和NaCl的电流响应非常微弱，AA和L⁃Cys的电流响应仅为葡萄糖的12%。由于在奶制品样品中AA和L⁃Cys的添加量远低于葡萄糖的含量，因此其对电极的影响可忽略不计，当再次添加葡萄糖时仍能观察到较强的电流响应。因此基于Ni(HCO3)2NPs/CP所构建的无酶葡萄糖传感器具有良好的专一性以及一定的抗干扰性能。

图8 (a)Ni(HCO3)2NPs/CP在含有5 mmol·L-1葡萄糖的0.1 mol·L-1NaOH溶液中第20圈和第80圈的CV曲线;(b)不同批次电极的重现性;(c)同一电极不同时间的稳定性;(d)Ni(HCO3)2NPs/CP在0.5 V电压下对0.1 mol·L-1葡萄糖和 0.01 mol·L-1干扰物的电流响应Fig.8 (a)CV curves of Ni(HCO3)2NPs/CP in 0.1 mol·L-1NaOH solution containing 5 mmol·L-1glucose at the 20th and 80th cycle;(b)Reproducibility of different batches of electrodes;(c)Stability of the same electrode at different times;(d)Current response of Ni(HCO3)2NPs/CP to 0.1 mol·L-1glucose and 0.01 mol·L-1interference at 0.5 V voltage

2.3.5 奶制品样品分析

通过对奶制品样品的加标回收来评估所制电极的性能。样品的初始浓度值由GB/T 5009.8⁃2016[25]中的高效液相色谱法获得。然后用Ni(HCO3)2NPs/CP工作电极对3个奶制品样品的葡萄糖含量进行测定，每个样品测量3次，结果如表2所示。检测结果表明Ni(HCO3)2NPs/CP工作电极检测到的样品中葡萄糖浓度加标回收率在99%～101%之间，证明了用该修饰电极所制备的葡萄糖无酶传感器在实际应用中的可行性。

表2 部分奶制品样品的检测结果Table 2 Detection results for some dairy product samples

3 结论

以导电碳纸作为基底采用一步水热法原位合成碳酸氢镍纳米颗粒，制备出Ni(HCO3)2NPs/CP工作电极构建无酶葡萄糖电化学传感器。电化学测试表明该电极对葡萄糖表现出优异的催化性能，Ni(HCO3)2NPs大大提高了复合材料的导电性，并为催化反应提供更多的反应位点。该传感器具有高灵敏度和低检出限，同时还具有优异的稳定性和抗干扰能力，在奶制品样品检测中应用良好。