南极磷虾油亚临界萃取工艺优化及挥发性成分分析

孙德伟 谢 强 李进伟 刘元法

(1.无锡商业职业技术学院，江苏 无锡 214153；2.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；3.江南大学食品安全与营养协同创新中心，江苏 无锡 214122；4.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

南极磷虾油主要成分有ω-3多不饱和脂肪酸、磷脂、虾青素、维生素E等生物活性物质[1]，其中磷脂型ω-3多不饱和脂肪酸占总脂肪酸的34%[2-3]，被誉为海洋卵磷脂[4]。当前，制备南极磷虾油主要采用溶剂提取和无溶剂提取两类[5-6]。采用溶剂制备南极磷虾油，通常选用丙酮、乙醇或正己烷等单一溶剂，但存在耗费时间长、效率低、溶剂残留及原料中部分生物活性成分易失活等弊端；也有先丙酮后乙醇两步溶剂法制备南极磷虾油的报道[7-8]，但两步法也存在耗时长、产物脱溶分离成本高等问题；采用超临界CO2夹带20%乙醇制备南极磷虾油，但需先对南极磷虾进行脱水干燥，干燥过程中的高温会破坏南极磷虾中的热敏成分[4，8]；采用超临界流体提取技术制备南极磷虾油，但超临界制备设备构造复杂、维护使用成本较高[9-10]。无溶剂提取酶法也被用于南极磷虾油的制备[11-12]，但专用酶的价格昂贵限制了其在脂质制备中的规模化应用，且提取水环境中磷脂乳化也会降低其提取率。基于此，当前亟需一种经济、污染小且能够最大限度保存南极磷虾油生物活性物质的制备方法。

亚临界流体提取技术具有工作压力低、工作温度相对较低、综合效率较高、总体投资和运行成本相对较低等优势，在一些特种植物油[13-14]和特种动物脂的分离制备中被小规模化应用[15-16]。部分学者[17-18]研究了亚临界萃取南极磷虾油技术，Xie等[19]系统研究了多种溶剂分离制备南极磷虾油，涉及到亚临界丁烷制备南极磷虾油，但该研究采用了亚临界丁烷分离小麦胚芽油的条件[20]。文章拟选择亚临界流体提取技术提取南极磷虾油，并对其提取工艺进行优化，旨在为南极磷虾油绿色工业化生产提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验原料及设备

南极磷虾粉：含水(9.0±0.5)%，-40 ℃保存备用，辽渔集团有限公司；

试验试剂：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

亚临界提取装置：BE-5L型，河南亚临界生物技术有限公司；

高效液相色谱：1260型，配备蒸发光散射检测器，美国安捷伦科技公司；

气相色谱：7820A型，美国安捷伦科技公司；

旋转蒸发仪：R205D型，无锡申科仪器厂；

离心机：5810型，德国艾门德公司；

pH计：FE28型，瑞士梅特勒—托利多公司；

分析天平：ME104E型，瑞士梅特勒—托利多公司；

磁力搅拌器：VORTEX 1型，德国IKA公司；

震荡摇床：CHA-S型，金坛荣华仪器公司。

1.2 试验方法

1.2.1 南极磷虾油分离 将500 g南极磷虾粉用布袋封口放入提取罐，抽真空。按料液比(m南极磷虾粉∶V丁烷)1∶5(g/mL)将亚临界溶剂丁烷泵入提取罐，外套热水循环控制提取温度，设定条件提取完成后将提取混合液导入分离罐减压蒸发分离产物。多次提取后合并提取物，离心过滤称重，并按式(1)计算南极磷虾油提取率。

(1)

式中：

m1——单位质量原料按试验方法制备的油的质量，g；

m0——单位质量原料按Folch方法[21]制备脂质的质量，g；

N——南极磷虾油提取率，%。

1.2.2 响应面优化南极磷虾油提取工艺 在前期试验的基础上，以提取时间、提取温度和提取压力为考察因素，采用Box-Behnken设计，以南极磷虾提取率为响应值优化南极磷虾油的亚临界制备工艺条件。

1.2.3 南极磷虾油挥发性成分分析 采用顶空固相微萃取和气相色谱—质谱/质谱(HS-SPME-GC-MS)检测南极磷虾油挥发性成分。取南极磷虾油10.0 g封闭于25 mL顶空瓶中，以封口膜密封。

(1)HS-SPME过程：对固相萃取柱(DVB/CAR/PDMS, 50/30 μm)进行预处理，将萃取装置上萃取柱插入GC进样口，270 ℃老化30 min，载气为氦气，流量1.0 mL/min；将萃取柱插入装有待测样品的顶空瓶上层，70 ℃震荡吸附30 min，随即将萃取柱插入GC进样口，250 ℃解吸5 min后进行GC/MS分析。

(2)GC/MS分析：GC条件为HP-5MS毛细管柱(长30 m，内径0.25 mm)，载气为99.99%氮气，流速1.0 mL/min；程序升温为45 ℃保持2 min，以3 ℃/min升至130 ℃，10 ℃/min升至240 ℃保持8 min；MS条件为电子轰击离子源，离子源温度250 ℃，电子能量70 eV，碎片扫描范围32～560(m/z)。未知化合物经计算机谱图库NIST、WILEY检索定性分析，根据相对峰面积定量。

1.2.4 统计学分析 采用同批次原料重复3次，使用SPSS 18.0软件分析方差(ANOVA)，结果以平均值±标准差表示，P<0.05时具有统计学差异。

2 结果与讨论

2.1 亚临界分离南极磷虾油工艺优化

2.1.1 响应面试验设计及结果 选取提取时间、提取温度和提取压力为主要因素，以提取率为响应值，根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理进行响应面法设计，试验因素与水平见表1，试验设计与结果见表2。

表1 试验因素水平及编码

2.1.2 模型的建立及方程分析 利用Design-Expert 7.0软件对表2中的响应值与各因素进行多元回归分析，得到二次多项式回归方程为：

表2 响应面试验设计及结果

(2)

表3 回归模型方差分析†

2.1.3 响应面分析 由图1可知，随着提取时间的延长，提取率呈升高趋势，前段升高快，后期升高平缓。随着提取温度的上升，提取率呈先增高后稍有下降趋势，当提取温度为40～50 ℃时，提取率达到最高。

图1 提取时间和提取温度对提取率的交互作用

由图2可知，随着提取时间的延长，提取率总体呈升高趋势，前段升高快，后期升高平缓。随着提取压力的上升，提取率呈缓慢上升趋势。

图2 提取时间和提取压力对提取率的交互作用

由图3可知，随着提取温度的上升，提取率呈先升高后降低趋势。而随着提取压力的上升，提取率呈缓慢上升趋势。

图3 提取温度和提取压力对提取率的交互作用

2.1.4 回归模型验证 根据回归模型计算得到亚临界丁烷制备南极磷虾油最佳工艺条件为提取时间132.74 min，提取温度42.07 ℃，提取压力1.08 MPa，南极磷虾油最高提取率可达81.95%。结合实际操作，将工艺条件修正为提取时间120 min，提取温度40 ℃，提取压力1.0 MPa，为验证结果的可靠性，进行3次重复试验，测得南极磷虾油提取率为(81.2±0.4)%，与预测值接近，说明二次回归方程模型合理，试验结果较理想。

响应面优化试验条件与邢要非等[23]亚临界丁烷制备棉籽油、刘日斌等[24]亚临界丁烷制备芝麻油、马燕等[25]亚临界丁烷制备杏仁油的提取条件较为相近，且其亚临界提取温度略有降低，这有利于动物性原料中热敏性成分的保护。此外，亚临界丁烷最佳提取时间的差异可能与原料性质有关，如芝麻油和杏仁油为植物来源原料。

2.2 南极磷虾油挥发性成分

为进一步研究亚临界丁烷准备南极磷虾油的性质，采用顶空固相微萃取和气相色谱—质谱/质谱(HS-SPME-GC-MS/MS)检测亚临界丁烷制备的南极磷虾油挥发性成分，其总离子流图如图4所示。

图4 南极磷虾油挥发物GC-MS总离子流图

经NIST、Wiley2008谱库串联检索，共检出醛类、酸类、烃类等化合物，其保留时间、化合物名称及相对峰面积见表4。

由表4可知，南极磷虾油主要挥发性成分有27种，其中2-癸烯醛、11-烯醛、癸酸为主要成分。丁浩宸等[26-27]发现，醚类、醛类是整虾的关键挥发性成分，其中头胸部的挥发性成分主要是(E,Z)-2,6-壬二烯醛、3-甲硫基丙醛、3-甲基丁醛、壬醛、苯乙醛、D-柠檬烯、(Z)-4-庚烯醛、二甲基硫醚、辛醛、苯甲醛，腹部挥发性物质主要是二甲基三硫醚、癸醛、壬醛、3-甲基丁醛、辛醛、D-柠檬烯、二甲基硫醚、(Z)-4-庚烯醛。Giogios等[28]发现虾粉和虾油挥发性物质不同，包括虾油在内的海洋油脂挥发性物质有较高含量的乙基呋喃、2-亚甲基丁基环丙烷、己醛、2,4-辛二烷、3,5-辛二烷；而虾粉中挥发性物质几乎检测不到不饱和环烃和萜类，呋喃含量较低。而南极磷虾油挥发性物质中也几乎不含不饱和环烃类和萜类，其呋喃含量也较低，总体组成与文献[26-28]基本一致，但具体含量有一定差别，可能是由于原料差异所致。综上，南极磷虾油中挥发性成分组成不如其脂肪酸具有稳定的组成和含量，但也能作为南极磷虾油真伪鉴定的一个特征性指标。

表4 挥发性组分组成及相对含量

3 结论

以南极磷虾粉为原料，采用亚临界丁烷分离制备南极磷虾油。结果表明，南极磷虾油的最佳亚临界制备工艺为提取温度40 ℃，提取压力1.0 MPa，提取时间120 min，此时南极磷虾油提取率为(81.2±0.4)%。顶空固相微萃取和气相色谱—质谱/质谱分析表明，该南极磷虾油挥发性成分主要为2-癸烯醛、11-烯醛、癸酸等27种，通过对比发现南极磷虾油中挥发性成分组成可以作为南极磷虾油真伪鉴定的一个特征性指标。后续可研究南极磷虾油的特殊性质。