二至丸有效成分配伍对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用

刘利利，李 银，周 英，刘颖新

(湖南中医药高等专科学校，湖南 株洲 412012)

肝脏是人体重要的代谢器官，肝损伤是各种肝脏疾病的常见病理基础，长期的肝损伤往往导致肝纤维化，严重时可导致肝硬化、肝癌，严重威胁人类的健康和生活质量，因此研发高效保肝药物具有十分重要的意义。

二至丸收载于2020年版《中华人民共和国药典：一部》(以下简称《中国药典》)，由酒女贞子及墨旱莲2味药组成，具有补益肝肾、滋阴止血之功效，临床上用于治疗肝肾阴虚、眩晕耳鸣、咽干鼻燥、腰膝酸痛、月经量多等症[1]。二至丸具有保肝作用[2-3]，但中药复方成分较多，在质量控制上存在一定问题，而探索成分配伍则可为中药复方研究提供思路。本实验采用CCl4诱导小鼠急性肝损伤模型，结合均匀试验设计，优选二至丸有效成分配伍与剂量，并探讨可能的作用机制，为二至丸的临床合理应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料

SPF级昆明小鼠雄性100只，体质量为(18.0±2.0)g，购自长沙天勤生物技术有限公司，动物许可证号SCXK(湘)2014-0011。小鼠常规喂养，自由饮水，实验开始前适应性饲养1周。特女贞苷(PS0331-0025MG)、蟛蜞菊内酯(PS0649-0020MG)，纯度>98%，购于成都普思生物科技股份有限公司；红景天苷(GZDD-0170)，纯度≥98%，购自贵州迪大科技有限公司；CCl4(20201109)为国产分析纯，购于天津科贸化学试剂有限公司，临用时用花生油配制成0.5% CCl4溶液；联苯双酯滴丸(200601)购于北京协和药厂；ALT(20201209)、AST(20201204)、MDA(20201209)、SOD(20201209)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器

AE240型电子分析天平(METTLER TOLEDO公司)，全波长酶标仪(美国Thermo Fisher，Multiskan GO)，H1650台式高速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，KQ3200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，超低温冰箱(中科美菱低温科技股份有限公司，DW-HL668)。

2 方法与结果

2.1 动物分组及给药

根据2020年版《中国药典》中二至丸用量的相关规定，结合3种活性成分在二至丸中的平均含量[4-5]，分别确定3个成分的剂量范围为特女贞苷130～190 mg/kg、蟛蜞菊内酯2～8 mg/kg、红景天苷15～45 mg/kg。按照U7(74)均匀设计表安排实验，得到均匀设计实验方案，见表1。将实验小鼠100只，随机分为10组：空白对照组、模型组、联苯双酯(阳性药)组、二至丸有效成分均匀设计配伍7组，每组10只。二至丸有效成分各配伍组根据表2方案，按剂量配比均以生理盐水为溶剂配制灌胃液，灌胃给药；联苯双酯组灌胃给予联苯双酯150 mg·kg-1；空白对照组和模型组灌胃给予生理盐水，1次/d，连续7 d。末次给药后1 h，模型组、联苯双酯组及二至丸有效成分配伍各剂量组一次性腹腔注射0.5% CCl4花生油溶液10 mL·kg-1，制作急性肝损伤模型，正常组腹腔注射等量花生油。造模后24 h，以小鼠摘眼球法取血，3 500 r/min离心5 min，分离血清，-80 ℃冰箱保存备检ALT、AST。取血后脱颈处死小鼠，剖腹，取一小块肝脏组织，加5 mL冷生理盐水制成10%的肝匀浆，-80 ℃冰箱保存备测MDA、SOD。

表1 因素水平

表2 有效成分配伍剂量 (mg·kg-1)

2.2 生化指标检测

按照试剂盒相应的说明书操作步骤测定小鼠血清ALT、AST 水平；硫代巴比妥酸法测定肝组织匀浆中MDA含量，黄嘌呤氧化酶法测定SOD 活力。

2.3 统计学分析

表3 指标评分

3 结果

3.1 对小鼠血清中ALT、AST的影响

各组小鼠ALT、AST水平见表4。由表4可知，与空白对照组相比，模型组血清ALT、AST水平明显升高(P<0.01)，说明实验造模成功。与模型组相比，二至丸有效成分各配伍组血清ALT、AST水平均明显降低(P<0.05，P<0.01)，表明二至丸有效成分各配伍组可以减轻CCl4所致小鼠急性肝损伤。

表4 有效成分配伍对CCl4肝损伤小鼠血清ALT、AST 活力的影响

3.2 二至丸保肝活性成分配比优选

分别以ALT、AST综合得分为指标，经二次多项式逐步回归法对数据进行处理，经二次多项式逐步回归，得到回归方程：Y=62.3+1.05×10-3X1-5.72×10-2X2X3(X1为特女贞苷，X2为蟛蜞菊内酯，X3为红景天苷)。方程经调整后r=0.993 7，F=157.5，P<0.05，回归方程显著。此方程中各因素的最优配比为：X1=190 mg·kg-1；X2=2 mg·kg-1；X3=15 mg·kg-1。

3.3 对小鼠肝脏MDA、SOD的影响

各组小鼠MDA与SOD活力见表5。由表5可知，模型组与空白对照组比较，肝脏MDA含量明显增高，SOD水平明显降低(P<0.01)，说明实验造模成功。与模型组比较，二至丸有效成分各配伍组肝组织MDA含量明显降低(P<0.05，P<0.01)，SOD活力明显增高(P<0.05，P<0.01)，结果表明，二至丸保肝活性成分配伍可能具有一定的抗氧化作用。

表5 二至丸有效成分配伍对CCl4肝损伤小鼠肝脏MDA含量、SOD活性的影响

4 讨论

(1)CCl4诱导的小鼠肝损伤模型是常用的动物模型，重现性较好，其作用机制较复杂。一般认为，CCl4可诱导活性氧生成增多，使磷脂分子中的不饱和脂肪酸氧化生成过氧化脂质，破坏细胞膜、细胞器膜及内质网，从而造成肝细胞损伤[7]。CCl4诱导肝细胞损伤后，细胞膜通透性增大或被破坏，使大量的ALT、AST释放入血，此时血清中的ALT及AST的活性升高，因此ALT、AST是反映肝损伤的重要指标[8]。

SOD是体内普遍存在的一种抗氧化酶，可以清除超氧阴离子自由基，防止其他活性氧形成。当CCl4诱导活性氧生成增多时，SOD因参与抗氧化而使其活性降低，抗氧化作用减弱，从而使质膜发生过氧化，最终造成肝细胞损伤[9]。在活性氧促使磷脂分子中的不饱和脂肪酸氧化生成过氧化脂质后，进一步分解可生成MDA等醛类物质[10]。因此，SOD及MDA既可作为反映脂质过氧化程度的指标，也是反映细胞损伤程度的指标，SOD活性越小或MDA含量越高，说明肝损伤的情况越严重。

本实验结果显示，模型组与空白对照组比较，血清中ALT及AST活性显著升高，肝脏中的SOD活性显著降低，MDA含量显著增多，差异均有统计学意义(P<0.01)，表明肝细胞出现明显损伤，提示造模成功。

(2)关于特女贞苷、蟛蜞菊内酯、红景天苷对肝损伤的保护作用已有报道，但特女贞苷、蟛蜞菊内酯、红景天苷3种活性成分配伍后对肝损伤的保护作用未见报道。本次实验应用均匀实验设计，对二至丸中特女贞苷、蟛蜞菊内酯、红景天苷3种成分配伍与剂量进行优选。均匀设计法是一种应用广泛的实验设计方法，可减少实验次数，以回归方程获得理论上的最优实验方案[11-12]，从而得出最优化的有效成分配伍与剂量，使实验结果更加可靠，因此可对二至丸的临床应用提供参考。

研究结果显示，与模型组比较，二至丸有效成分均匀设计配伍7组中小鼠的血清ALT与AST活性显著降低，肝脏中SOD活性显著升高、MDA含量显著减少，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，表明特女贞苷、蟛蜞菊内酯、红景天苷3种活性成分配伍对急性肝损伤具有明显的保护作用。