五加参归芪精改善小鼠心气虚量效关系研究

姜文月，韩淑丽，唐明哲，曲佳乐，高 陆，邢 成，李鹏东*

(1.广州医科大学附属第六医院/清远市人民医院，广东 清远 511500；2.吉林省现代中药工程研究中心有限公司，吉林 长春 130012；3.通药制药集团股份有限公司，吉林 通化 134001)

“五加参归芪精”是由刺五加、黄芪、当归3味中药组方制备的中药口服液，具有扶正固本、补气固表、补血养血的功效，用于久病衰弱、失眠自汗、腰膝酸软、气短心悸[1]。本研究通过建立小鼠心气虚实验模型考察五加参归芪精改善心气虚的药效作用及量效关系，为临床应用推广提供数据支撑。

本研究选择“基础进食+负重游泳+灌服心得安”方法复制小鼠心气虚模型，饥则损气、劳则耗气，力竭游泳增加小鼠耗氧量、损伤小鼠正气，且使小鼠受到惊吓、耗伤心气，符合中医心气虚证的病因；灌服心得安，抑制交感神经对心脏的兴奋性刺激，使心肌缺血缺氧而致心肌结构功能改变，进一步将气虚定位于心[2-7]。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Spectra Max Plus 384型酶标仪(美国美谷分子仪器有限公司)；Ultra-6100紫外-可见分光光度计(北京普源精电科技有限公司)；JY2003电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司，精度1 mg)；TDZ5-WS台式低速多管自动平衡离心机(长沙维尔康湘鹰离心机有限公司)；DK-98-ⅡA水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2 试药

五加参归芪精(批号180519)由通药制药集团股份有限公司提供；人参口服液(批号180602)由吉林天力泰药业有限公司提供；心得安片(盐酸普萘洛尔片，批号E190147)购自亚邦药业集团股份有限公司；小鼠白介素-2(IL-2)测试盒(批号20190615)、小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)测试盒(批号20190617)、总蛋白定量测定试剂盒(批号20190612)、总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(批号20190612)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(批号20190611)、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(批号20190612)、肌酸激酶(CK)测定试剂盒(批号20190613)均购自南京建成生物工程研究所；氯化钠注射液(批号181041D01，浓度为0.9%)购自哈尔滨三联药业股份有限公司。

1.3 实验动物

SPF级ICR小鼠，体质量18～22 g(6～8周龄)，雌雄各半，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，实验动物生产许可证为SCXK(吉)-2016-0003，检疫合格。日常饲养与管理：动物饲养于放有垫料的PC聚碳酸酯鼠盒中，每笼6只，自由饮用蒸馏水及进食标准颗粒饲料；饲养间温度20.0～25.9 ℃，日温差0～4.9 ℃；饲养间湿度40.0%～70.0%；换气次数≥15次/h；动物照明，昼夜明暗交替时间12 h/12 h。

2 方法

2.1 给药剂量

五加参归芪精产品说明书用法与用量为口服，1～2次/d，10 mL/次，即临床服用剂量为10～20 mL/d，每人按平均60 kg体质量计算，每日服用10 mL，折算小鼠剂量为1.52 mL/kg；每日服用20 mL，折算小鼠剂量为3.03 mL/kg。因此，本研究设置0.76、1.52、3.03、6.06 mL/kg等4个考察剂量组。

阳性药为人参口服液，产品用法与用量为口服，10 mL/次，3次/日，即每日服用30 mL，折算小鼠剂量为4.55 mL/kg。

药物配制：取适量药品溶液，采用生理盐水稀释至给药浓度，小鼠灌胃体积为20 mL/kg。

2.2 实验造模及分组给药

本实验0～16 d为造模期，从第17 天起给药，连续7 d，第24天进行实验结果检测。

实验造模0～16 d：①从第1天起，给予小鼠基础量进食，即每天15 g饲料/100 g体质量，共16 d；②从第1天起，每日在30 ℃恒温水中负重游泳至力竭为止(负重为小鼠体质量的5%，力竭标准为动作明显失调、慌张、鼻部在水面上下浮动)，共13 d；③从第13天起，每日灌服心得安溶液5 mL/kg(折算心得安片24 mg/kg，生理盐水配制)，连续4 d，至第16天[8-11]。

分组给药：ICR小鼠适应性喂养后，随机选取12只作为正常组，自由饮食，从第13天起，每日灌服生理盐水5 mL/kg，连续4 d，至第16天，从第17天起，灌服生理盐水20 mL/kg，连续7 d，第24天实验结束。其余均为造模组，按上述方法造模，第17天随机抽取12只作为模型组，其余随机分为5组，即五加参归芪精4个剂量组及阳性药组，以20 mL/kg体积灌胃给与对应药物，连续7 d，至第24天实验结束；模型组连续7 d灌胃20 mL/kg生理盐水。上述各实验组小鼠，雌雄各半，单笼饲养。

2.3 指标检测

于第24天，测定游泳力竭时间，而后摘除眼球取血，3 000 r/min离心10 min收集血清，采用试剂盒测定TNF-α及IL-2，根据使用说明书进行操作；取心脏，留取一半用于心肌病理切片，另外一半心肌组织匀浆，检测LDH、CK、SOD、MDA，根据使用说明书进行操作。

2.4 统计学处理

3 结果与分析

3.1 小鼠存活情况

本研究采用“基础进食+负重游泳+灌服心得安”方法复制小鼠心气虚模型，考察五加参归芪精改善心气虚的量效关系，在造模负重游泳过程中及实验结束时检测游泳力竭时间，会有小鼠因力竭呛水死亡，各组存活小鼠情况统计见表1，以下各指标测定以存活小鼠计算。

表1 小鼠存活情况

3.2 一般情况及体征

与正常组比较，模型组小鼠从初期的觅食活动增强、频咬铁笼，到逐渐安静，而后出现精神不振、活动减少、毛松、眼眶变小、鼠尾颜色淡白、拱肩缩背、行动迟缓，尤其从第13天起连续灌服心得安后，小鼠出现精神萎靡、倦怠，尤以强迫活动后为甚。上述症状符合小鼠心气虚模型的症状体征。

3.3 游泳力竭时间测定结果

实验结果见表2，与正常组比较，模型组游泳力竭时间显著缩短(P<0.01)；与模型组比较，阳性药组显著延长小鼠游泳力竭时间(P<0.05)，五加参归芪精3.03、6.06 mL/kg剂量组显著延长小鼠游泳力竭时间(P<0.05)，0.76、1.52 mL/kg剂量组无显著性差异(P>0.05)。

3.4 血清TNF-α、IL-2测定结果

TNF-α：与正常组比较，模型组TNF-α显著升高(P<0.01)；与模型组比较，阳性药组TNF-α显著降低(P<0.05)，五加参归芪精3.03、6.06 mL/kg剂量组TNF-α显著降低(P<0.01)，0.76、1.52 mL/kg剂量组无显著性差异(P>0.05)。实验结果见表2。

IL-2：与正常组比较，模型组IL-2水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，阳性药组IL-2显著降低(P<0.05)，五加参归芪精1.52、3.03、6.06 mL/kg剂量组IL-2显著降低(P<0.05、P<0.01)，0.76 mL/kg剂量组无显著性差异(P>0.05)。实验结果见表2。

表2 小鼠游泳力竭时间及血清TNF-α、IL-2测定结果

3.5 心肌CK、LDH测定结果

CK：与正常组比较，模型组CK显著升高(P<0.01)；与模型组比较，阳性药组CK显著降低(P<0.01)，五加参归芪精3.03、6.06 mL/kg剂量组CK显著降低(P<0.05，P<0.01)，0.76、1.52 mL/kg剂量组均无显著性差异(P>0.05)。实验结果见表3。

LDH：与正常组相比，模型组LDH显著升高(P<0.05)；与模型组比较，阳性药组LDH显著降低(P<0.01)，五加参归芪精3.03、6.06 mL/kg剂量组CK显著降低(P<0.05，P<0.01)，0.76、1.52 mL/kg剂量组均无显著性差异(P>0.05)。实验结果见表3。

表3 小鼠心肌CK、LDH、SOD、MDA测定结果

3.6 心肌SOD、MDA测定结果

SOD：与正常组相比，模型组SOD显著降低(P<0.01)；与模型组比较，阳性药组无显著性差异(P>0.05)，五加参归芪精0.76、3.03、6.06 mL/kg剂量组SOD显著升高(P<0.01)，1.52 mL/kg剂量组无显著性差异(P>0.05)，实验结果见表3。

MDA：与正常组相比，模型组MDA显著升高(P<0.01)；与模型组比较，阳性药组无显著性差异(P>0.05)；五加参归芪精0.76、1.52、3.03、6.06 mL/kg四个剂量组MDA均显著降低(P<0.01)，实验结果见表3。

3.7 心肌病理切片

正常组：心肌纤维排列规整，细胞核多位于肌纤维中央，多为一个，心肌间质和心肌内血管未见异常，心内膜、外膜未见异常，为正常心肌结构。见图1。

模型组：出现心肌结构损伤，表现为心肌纤维排列不规则，肌纤维中度断裂，心肌间质和心肌内血管轻度充血，心肌纤维可见淋巴细胞侵润。见图1。

阳性药组及五加参归芪精4个剂量组：各组小鼠心肌结构损伤减轻，心肌纤维排列较规则，心肌内血管充血及淋巴细胞侵润减轻或恢复。见图1。

综上，五加参归芪精具有改善小鼠心气虚的药效作用，综合考察游泳力竭时间、血清IL-2、TNF-α、心肌LDH、CK、SOD、MDA及心肌病理切片等指标，在设置的0.76、1.52、3.03、6.06 mL/kg 4个剂量条件下，药效作用具有量效相关性，五加参归芪精3.03、6.06 mL/kg剂量对上述各项指标均具有显著改善，药效作用显著。

4 讨论

在力竭运动所致心气虚证造成小鼠心肌损伤的过程中，自由基损伤学说及炎症反应发挥着重要作用，因此测定自由基代谢水平及细胞炎性因子含量有重要意义[10]。SOD作为反映氧自由基清除能力的指标，对机体的氧化与抗氧化平衡至关重要，MDA是体内脂质过氧化物的重要代谢产物，MDA含量可较好地反映组织脂质过氧化程度，间接反映出细胞损伤程度，SOD活力降低，MDA含量升高，表明机体抗氧自由基攻击的活性降低。五加参归芪精0.76、3.03、6.06 mL/kg剂量组提高了心气虚证小鼠心肌SOD活力、降低了MDA含量，表明其可通过改善小鼠心肌自由基代谢，增强心肌抗氧化能力、减少自由基损伤而保护心肌。TNF-α及IL-2是重要的细胞炎性因子，TNF-α及IL-2含量增加可介导炎症反应损伤心肌。五加参归芪精3.03、6.06 mL/kg剂量组降低了血清TNF-α、IL-2水平，表明其能够抑制细胞炎性因子释放而保护心肌。

CK和LDH是重要的心肌酶，当心肌受损时CK、LDH因心肌细胞线粒体膜破裂而释放，现已公认心肌酶释放是心肌受损害程度的标志，因此检测CK、LDH含量可作为观察心肌受损的指标[9]。五加参归芪精3.03、6.06 mL/kg剂量组降低了心肌CK、LDH含量，表明其可有效改善心肌损伤。