橄榄苦苷对去势SD大鼠绝经后骨质疏松的治疗作用及机制*

刘慧兰,赵爱国,侯安丽

[中国科学院大学深圳医院(光明) a.妇科;b.内分泌科，深圳 518106]

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)分为自然绝经和人工绝经后骨质疏松，是骨质疏松症(osteoporosis,OP)中最常见的一种类型[1]。美国绝经后妇女中30%患有PMOP，我国50岁以上妇女中超过50%发生PMOP[1]。PMOP最主要的并发症是骨折和再发骨折的风险增高。美国每年用于PMOP相关疾病的治疗费用高达130亿美元[2]。国内有研究显示，PMOP致髋部骨折患者平均住院时间为35天，平均花费为15737元[3]。同时妇科恶性肿瘤患者人工绝经术后引发的低雌激素效应，以及术后辅助性化疗也可加重骨质的流失[4]，由于该类患者增加等原因使PMOP的发病呈年轻化及骤增趋势，进一步增加了绝经后骨质疏松高发病率及其并发症的高致残率、高致死率，使PMOP成为我国医疗卫生面临的重大挑战[5]。目前国内外对雌激素下降所致的骨质疏松症常采用激素替代治疗(hormone replacement therapy，HRT)。HRT虽然降低了骨质疏松和骨折的危险性，但研究证实HRT是妇科恶性肿瘤术后发生发展的危险因素[6]，故术后引发的骨质疏松症，由于其用药的局限性使得治疗更是难中之难。本课题组前期实验表明[7]，橄榄油可以延缓骨质的流失，但作用成分及其疗效尚不明确。本文在雌性SD大鼠PMOP模型上服用橄榄油中提取的橄榄苦苷，通过监测动物骨密度变化、骨代谢指标及子宫系数，明确橄榄苦苷不仅能延缓PMOP，而且不产生雌激素副作用，为防治PMOP开发天然药物提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验伦理 所有的实验动物都经过中国科学院大学深圳医院(光明)医学伦理委员会的批准。动物手术均在5.2%氯胺酮腹腔注射麻醉下进行。动物实验管理依照实验动物管理委员(Institutional Animal Care and Use Committee,IACUC)会指导方案进行。

1.2 实验药品 橄榄苦苷500g(药编号32619-42-4)。己烯雌酚0.5mg片剂(药编号H34021250)，5.2%氯胺酮(0.5mL/100g)。

1.3 实验方法

1.3.1 PMOP动物模型的建立 将80只SD雌性大鼠在温度18～25℃，湿度50%～60%的环境中饲养1周，在饲养的过程中没有接触过任何药物[8]。饲养1周后,将80只SD大鼠分为假手术组(Sham,20例)，去势组(OVX,60例)。假手术组SD大鼠接受双侧剖腹手术，去除卵巢周边脂肪，但卵巢留在原位，OVX组SD大鼠通过腹侧入路进行双侧卵巢切除术[9]。

1.3.2 实验动物的分组和药物处理 将术后80只模型动物随机分为假手术组(Sham组,20例)，去势组(OVX组,20例)，去势+橄榄苦苷组(OVX+Oleuropein组,20例)，去势+雌激素组(OVX+E2组,20例)；去势+橄榄苦苷组和去势+雌激素组除了分别每天以200μg橄榄苦苷和25μg/kg E2灌胃，其他饮食起居与Sham组和OVX组保持一致，连续饲养12周。

1.3.3 各组SD大鼠骨密度测量 采用变异系数<0.11%的高分辨率的双能X光骨密度测量仪(DEXA,HOLOGIC Company,American)测量各组中SD大鼠的腰椎(L3，L4)和左股骨颈的骨密度。

1.3.4 各组中子宫的湿重 用5.2%胺碘酮麻醉各组SD大鼠，打开腹膜取出子宫，分离子宫周边脂肪组织，计算各组子宫系数(子宫湿重/体重)，并进行比较。

1.3.5 各组血清中OPG/RANKL 实验12周后,各组SD大鼠拉颈处死，立即开胸，分别用5mL注射器抽取左心室血液，放于非抗凝管中，4℃ 3000r/min离心。用移液枪将血清吸出放于EP管中，-20℃保存，以备进行血清学指标的检测，ELISA法检测四组血清中OPG、RANKL含量。具体操作步骤按各试剂盒说明书操作。

2 结 果

2.1 SD大鼠饲养12周后各组骨密度的变化 各组SD大鼠饲养12周后，OVX组腰椎和左股骨的平均骨密度均低于其他三组，差异有统计学意义(P<0.05)。OVX+橄榄苦苷组与OVX+E2及Sham组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。表明橄榄苦苷对维持骨密度有很好的效果(表1)。

表1 SD大鼠饲养3个月后各组腰椎及左股骨骨密度的变化

2.2 各组中子宫湿重与子宫系数的比较 与Sham组相比，OVX组和OVX+oleuropein组的子宫湿重和子宫系数降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；OVX+E2和OVX+oleuropein组的子宫湿重和子宫系数比较，差异有统计学意义(P<0.05)。表明橄榄苦苷不具有促进子宫内膜增生的雌激素作用。见表2。

表2 各组中子宫湿重与子宫系数的比较

2.3 四组血清中OPG/RANKL含量的比较 与其他三组相比较，OVX组血清中OPG水平较低(P<0.05);与Sham组相比较，OVX+E2和OVX+oleuropein组中OPG水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)，但后两组的OPG水平并无差异(P>0.05)。与OVX组相比，Sham、OVX+E2、OVX+oleuropein组血清中RANKL明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；而OVX+oleuropein组与OVX+E2组相比，血清中RANKL含量更低(P<0.05)，见表3。

表3 四组中OPG/RANKL水平比较

3 讨 论

橄榄苦苷是从天然橄榄油中提取出来的酚类化合物，属于裂环烯醚萜类。研究表明，橄榄苦苷不仅能减少骨质流失预防骨质疏松[10]，而且还具有抗氧化、抗炎[11]、抗子宫内膜癌的作用和抗乳腺癌特性[12]，同时能预防心血管疾病[13]。目前，使用橄榄苦苷预防绝经后骨质疏松症的研究较少。本研究发现，OVX+橄榄苦苷与OVX组相比，SD大鼠的腰椎及左股骨的骨密度明显增加(P<0.05)，并且与OVX+E2及Sham组相比骨密度无差异(P>0.05)。表明橄榄苦苷能通过提高骨密度防止骨质的流失。

对于骨骼系统，雌激素通过与雌激素受体结合来调节成骨细胞的增殖、分化、基质沉积、矿化、机械应力反应和基质蛋白合成。当雌激素与成骨细胞中的雌激素受体结合时，成骨细胞会分泌胶原酶、细胞因子和生长因子来促进骨形成。有研究[14]提出，雌激素受体β在MG63细胞破骨细胞分化过程中的基质蛋白合成中起重要作用。雌激素水平在诱导绝经后状态下显著降低，导致骨质流失和骨质疏松。橄榄苦苷和雌激素具有相同的芳香结构，并具有拮抗作用，竞争性结合雌激素受体[15]。然而，橄榄苦苷是否具有与雌激素相同的作用尚不清楚。本研究表明，与OVX+E2组相比，OVX+oleuropein组的子宫湿重和子宫系数降低(P<0.05)；与OVX组相比，OVX+E2组的子宫湿重和子宫系数显著增加(P<0.05)，OVX+橄榄苦苷组的子宫湿重和子宫系数差异无统计学意义(P>0.05)。表明橄榄苦苷不具有促进子宫内膜增生的雌激素作用，但其具体机制有待进一步研究。骨质疏松症的特征是骨组织微结构的减少和恶化，从而增加骨的脆弱性和骨折易感性，骨丢失主要是由于破骨细胞的数量增加和功能增强[16]。其中OPG、RNAK和RANKL在调节成骨细胞和破骨细胞之间的相互作用中起着重要作用。OPG和RANKL是肿瘤坏死因子受体家族的成员，RANKL与RANK结合，增加破骨细胞分化和活性，抑制破骨细胞凋亡[17]。OPG可以与RANKL结合，减少破骨细胞的激活[18]。本实验显示，与OVX组相比，OVX+oleuropein组血清中OPG水平明显升高(P<0.05);而与OVX+E2组相比，OPG水平无显著差异(P>0.05)；与OVX组相比，OVX+oleuropein血清中RANKL明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，并且与OVX+E2组相比，血清中RANKL含量也降低(P<0.05)。本研究结果显示，橄榄苦苷可增加去势SD大鼠血清中OPG表达，同时降低RANKL水平。表明橄榄苦苷可能通过调节OPG及RANKL的水平来防止骨的吸收，从而达到防治骨质疏松，但更深入的机制还有待后续的实验研究进一步证明。

综上，橄榄苦苷可通过增加绝经后骨密度延缓骨质疏松，无雌激素副作用，是一种很有前途的治疗绝经后骨质疏松症的药物。但其作用机制尚未完全阐明，有待于进一步探索。