不同取样方式HPV分型、定量检测的效果对比

涂 琴，李 凌，刘 英

(1.九江市妇幼保健院妇科，九江 332000；2.江西省妇幼保健院肿瘤科，南昌 330006；3.德兴市妇幼保健院妇产科，德兴 334200)

据统计，2018年全球宫颈癌病例约57万例，其中31万例死亡，宫颈癌是女性常见癌症之一，甚至居经济欠发达国家女性癌症榜首[1]。据2020年全球癌症负担数据显示，2020年我国宫颈癌新发病例数11万，死亡病例数6万。宫颈癌发病率在经济欠发达国家较以前无明显变化，但在经济发达国家呈明显下降趋势，宫颈癌筛查覆盖率是解释其发病率差异性的重要因素[2]。相对细胞学检查敏感性及阴性预测值低的特点，HPV检测具有更高的敏感性及阴性预测值。HPV筛查方案比细胞学筛查更有效，与联合筛查效果相当，但经济成本更低[3]。中华预防医学会公布的子宫颈癌综合防控指南[4]中推荐HPV筛查作为筛查方案之一。自取样HPV筛查凭借着操作简单、更方便、可重复取材、女性依从性提高的特点，可提高宫颈癌筛查覆盖率[5]。本研究用核酸分型定量法(BMRT)对自取样、医取样标本分别进行HPV检测，评价自取样HPV分型、载量检测能否达到医取样本同等的效果。

1 资料与方法

1.1 资料来源 依托国家“两癌”筛查项目，以江西省德兴市“两癌”筛查点宫颈癌筛查对象为基础，2019年11月至2019年12月共招募1894例筛查女性入组。由德兴市妇幼保健院承担研究对象的确立、资料收集及标本采集，课题组承担课题的设计和质控。入选标准：年龄25～64岁妇女；有性生活史；无临床妊娠；近3年未参加“两癌”筛查；无宫颈癌疾病史；了解研究程序，自愿参加本临床试验。本研究经九江市妇幼保健院伦理委员会批准。

1.2 方法 先由医师取样保存在液体保存管中，然后在医师的指导下由筛查女性进行阴道自取样，自取样本涂布在固体转运卡或液体保存管储存(1313例采用固体保存转运方式，581例采用传统的液体保存转运方式)。医师取样标本均采用传统的液体保存转运方式作为对照组。7天内分别对医取样本和自取样本进行检测，用硕世生物科技有限公司的21-HPV分型定量检测(BMRT荧光PCR法)，可检测出14种高危HPV(high risk human papillomavirus hrHPV)亚型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)和7种中、低风险HPV亚型(HPV26、53、82、73、6、11和81)及阳性亚型的病毒感染单位(拷贝数/10000个细胞)。

1.3 阴道镜检查和病理检查 对于HPV初筛阳性女性，建议直接转诊阴道镜检查并在阴道镜下行宫颈活检，若HPV阳性女性不愿意进行阴道镜检查，则建议分流TCT检查。病理结果作为评价自取样、医取样筛查效果的金标准。

1.4 统计学处理 采用SPSS 23.0进行统计学处理。病毒感染单位经正态检验不符合正态分布，用中位数表示，采用Wilcoxon秩检验。计数资料率的比较采用χ2检验。计算Kappa值比较自取样本、医取样本检测出HPV阳性亚型的一致性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

1894例筛查女性中，自取样本液体转运组581例中17例女性未进行自取样，11例为无效标本，样本合格率为98.0%；固体转运组1313例中40例女性未进行自取样，7例为无效标本，样本合格率为99.5%。液体转运组、固体转运组分别有553、1266例合格标本。1819例医取样本、自取样本检测数据均完整者纳入本研究。

2.1 自取样本与医取样本HPV阳性率比较 自取样本与医取样本所有21种HPV亚型阳性率分别为15.72%(286/1819)、15.83%(288/1819)，自取样本中固体组、液体组阳性率分别为15.09%(191/1266)、17.18%(95/553)，三种标本比较差异无统计学意义(χ2=1.292,P=0.524)。自取样本与医取样本14种常见hrHPV亚型阳性率分别为11.65%(212/1819)、12.04%(219/1819)，自取样本中固体组、液体组阳性率分别为11.53%(146/1255)、11.93%(66/533)，三种标本比较差异无统计学意义(χ2=0.189,P=0.910)(表1)。

表1 3种样本HPV阳性率的比较

2.2 自取样本与医取样本HPV阳性亚型分布及一致性比较 3种标本中，无一例HPV45阳性。14种常见hrHPV亚型中，HPV阳性率位于前五位的分别为：HPV52、16、58、68、39型。(图1)。自取样、医取样两种不同取样方式检测出HPV16、18、52、58阳性的一致性评价的Kappa值分别为0.99、0.98、0.99、0.99(表2)。

图1 3种样本的14种常见hrHPV亚型分布

表2 两种不同取样方式检测出HPV阳性亚型的一致性评价

2.3 自取样本与医取样本HPV病毒载量的比较 自取样本、医取样本HPV单一亚型感染均为214例，自取样本病毒感染单位明显多于医取样本(中位数分别为：5096.1、2463.3)，两者比较差异有统计学意义(Z=-2.499，P=0.012)。自取样本HPV总感染(单一亚型及两种、两种以上亚型感染)病毒感染单位明显多于医取样本(中位数分别为5733.5、2073.6)，两者比较差异有统计学意义(Z=-4.123，P=0.000)。自取样本中，固体组、液体组的单一亚型病毒感染单位中位数分别为10775.3、1477.2，两者比较差异有统计学意义(Z=-3.308，P=0.001)。两组的总病毒感染单位中位数分别为9985.2、3535.1，两者比较差异有统计学意义(Z=-3.317，P=0.001)。固体组的病毒感染单位明显多于液体组。自取液体和医取样本两组单一亚型、总病毒感染单位分别比较，差异无统计学意义(Z=-0.601、-0.797，P=0.548、0.426)。

2.4 HPV阳性女性的阴道镜及病理结果 335例HPV阳性女性中，162例进行TCT检测，共93例女性行阴道镜检查，包括TCT结果≥意义不明确的非典型鳞状细胞(atypical squamouscells of undetermined significance,ASC-US)者及HPV阳性女性直接转诊者。根据病理结果分组：HSIL+组18例，LSIL组20例，病理阴性组55例。HSIL+组18例患者，医取样本HPV均为阳性，自取样本16例阳性，16例患者两种取样标本HPV阳性亚型基本一致。其中，10例患者两种样本均检测出HPV16阳性(单一亚型或者混合感染)。LSIL组20例患者，医取样本及自取样本均为阳性，且20例患者HPV阳性亚型基本一致。其中，7例患者两种样本检测出HPV16阳性(单一亚型或者混合感染)，7例患者两种样本检测出HPV52阳性(单一感染或者混合感染)，5例患者两种样本检测出HPV58阳性(单一亚型或者混合感染)。病理阴性组55例患者，医取样本HPV均为阳性，自取样本50例阳性。两种取样方式比较,差异无统计学意义(χ2=0.082，P=0.96)。见表3。

表3 不同病理结果自取和医取样本HPV阳性情况的比较

3 讨 论

3.1 自取样HPV检测作为宫颈癌初筛方案的可行性 我国边远及农村地区医疗资源匮乏，宫颈癌筛查覆盖率低，且细胞学医师缺乏。而经济发达国家的经验已经证实,通过提高宫颈癌筛查覆盖率，可极大降低宫颈癌发病率[6]。提高宫颈癌筛查覆盖率，是我国公共卫生迫在眉睫的问题。HrHPV感染是导致宫颈癌发生的重要因素，这一点已得到共识。HPV检测具有高临床敏感性、高阴性预测值、客观、可重复性好和不需细胞学医师等特点[7]，筛查间隔时间长，可节约医疗资源[8]。HPV筛查逐渐成为主流的初筛方式，2014年起我国在“两癌”筛查项目中采取HPV筛查方案。美国阴道镜检查和子宫颈病理学会(ASCCP)2019版指南[3]亦推荐HPV检测作为宫颈癌的初筛方案，并提出了风险“基于HPV感染”的观点。而女性采取自取样的方式进行HPV检测，不需要医疗设施及妇科检查，操作方便,不受空间、时间及交通限制，便捷性提高,操作可重复性高;由社区或网络途径完成筛查女性的召集、沟通及样本的收集，降低对病理科医师及妇科医师的需求，可作为经济欠发达地区的宫颈癌筛查方案。

本研究发现，自取样本、医取样本的HPV16、18及14种常见HrHPV、所有21种HPV阳性率均无明显差异，两种不同取样方式检测出HPV16、18、52、58阳性的一致性评价的Kappa值分别为0.99、0.98、0.99、0.99，表明两种取样方式检测出HPV阳性亚型高度一致。这与吴瑞芳等[9-10]研究成果一致。筛查效果方面，HSIL+组18例、LSIL组20例患者，仅HSIL+组自取样本有2例阴性，其余36例阳性病例的自取样本与医取样本HPV亚型基本一致。

应用PCR为基础的HPV检测方法进行自取样筛查，可得到和医取样相似的敏感性[11]。国外对19523例女性的一项随机对照研究[12]发现，自取样本、医取样本均采用固体卡保存转运，自取样组细胞数明显多于医取样组，但是两组的HPV病毒载量无明显差异，据此可得知自取样组病毒感染单位低于医取样组。本研究中病毒感染单位的比较：自取样组高于医取样组，自取固体组高于自取液体组，而使用同一种转运方式的自取液体组与医取样组无明显差异。表明同样采用液体保存转运方式，自取样组病毒感染单位并不高于医取样组，自取样本病毒感染单位高的原因为自取固体组病毒感染单位明显高于其他两组。病毒感染单位的差异性主要不是由于取样方式不同，而是保存转运方式不同导致的。表明自取样方式并不影响HPV检测的病毒载量，而固体保存转运方式较传统的液体保存转运方式病毒载量更高。目前对于两种取样方式之间病毒载量差异性的研究尚不多，这仍需更多研究来证实。固体卡的优势还体现在：体积小、转运方便、不易污染、简化了标本DNA的提取，适用于大量自取样本的储存、运输。这对于提高经济欠发达地区宫颈癌筛查覆盖率，有着很大提升空间。

3.2 自取样HPV分型、定量同步检测作为HPV阳性女性宫颈癌初筛并分流方案的展望 HPV检测敏感性高，特异性较低，需对HPV阳性女性进行分流、风险预测，筛查出高危人群，实行宫颈癌风险的量化管理。我国山西省一项时间跨度10年的研究[13]发现，HPV病毒载量影响宫颈癌前病变的进展，可作为HPV阳性病例的分流指标。孙蓬明等[14]对21-HPV分型、定量检测的研究发现，HPV16、31、33、52、58亚型病毒载量与宫颈病变程度呈正相关，而HPV18、45、56、59亚型则无这种相关性。这与另两项研究[15-16]得出的结论一致：型别接近HPV16的A9组亚型(52、58、31、35)病毒载量与宫颈病变进展正相关，型别接近HPV18的A7组亚型(18、39、45、59)相关性不明显。通过HPV阳性亚型的定量检测可同时实现分流处理。本研究中一次自取样、一次PCR检测即可实现HPV同步分型、定量检测，宫颈癌筛查同时完成HPV阳性人群的分流筛查，减少HPV阳性女性往返医院的次数，可提高筛查效率。但本研究对象为我省“两癌”筛查女性，大量农村妇女外出务工，HPV阳性者有80例失访，失访率23.88%。

综上所述，核酸分型定量法检测自取样HPV与医取样HPV效果相当，可作为宫颈癌初筛方案。