基于网络药理学分析七味都气丸治疗慢性阻塞性肺疾病的作用机制

张海东，曲妮妮

(1． 辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032；2. 辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种以咳嗽、咳痰、喘息、胸闷、气短为主要临床表现的，以持续性气流受限为主要特征的慢性疾病。随着人口老龄化的逐渐加剧，COPD的发病率及病死率也在逐年增高，并且COPD的并发症较多，如呼吸衰竭、肺源性心脏病、自发性气胸、胃食管反流、骨质疏松、抑郁症、焦虑症等，该病病程长、花费大，对生活质量有较大的影响。西医治疗COPD主要以抗感染、抗炎、解痉平喘、化痰、扩张支气管等手段为主，其中激素治疗效果显著，但不可避免地带来一系列不良反应，且会影响体内的多巴胺及5-羟色胺含量，影响人体情绪，诱发抑郁、焦虑等，且长时间应用激素会导致骨质疏松、胃应激性溃疡等疾病。 近些年很多研究表明，中西医结合治疗COPD可减少西药带来的不良反应，并协同增强其药物作用[1-2]。七味都气丸为清代医家张温所著《张氏医通》中所记载的经典方剂，其中仅熟地黄、山萸肉、山药、泽泻、牡丹皮、茯苓、五味子7味中药，为补肾敛肺、治疗肺肾气虚证的经典方剂，此方为千古名方“六味地黄丸”加一味收敛之药——五味子组成，临床常用于喘病肺肾气虚证的治疗，疗效显著。本研究采用网络药理学方法分析七味都气丸治疗COPD的作用机制及通路，旨在为中医药治疗该病的研究提供进一步参考。

1 资料与方法

1.1七味都气丸有效成分筛选 通过TCMSP数据库对七味都气丸中各味中药进行有效成分检索，并根据口服药物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18为筛选条件进行筛选，最后得到各药物有效成分。

1.2七味都气丸靶点预测筛选及复方活性成分-靶点网络构建 对筛选得到的有效活性成分，利用TCMSP数据库中的化合物关联靶点(Related Targets)，通过Activeperl 5.28.1软件运行getTargrts.pl脚本将7味中药的活性成分进行逐一配对潜在靶点(Targets Name)。运用addSymbol.pl脚本通过UniProt数据库对靶点处理，得到标准名称(Targets Symbol)，经过以上数据库得到的靶点即为中药中活性成分相关靶点。最后，利用Gene Cards数据库对COPD相关靶点筛选，得到疾病相关靶点。运用R 3.6.3软件将药物活性成分相关靶点与疾病相关靶点取交集，重合的靶点即为七味都气丸活性成分作用于疾病的相关靶点，得到药物-疾病的重合靶点，并制作韦恩图。根据各成分性质的不同予以标记，运用Cytoscape软件进行中药-化合物-靶点-疾病网络的构建及进行可视化分析。

1.3蛋白互作网络构建及可视化分析 利用String在线数据库对靶点的蛋白间相互作用(protein protein interaction,PPI)进行分析，将靶点信息导入String数据库，物种选择人类(Homo sapiens)，将蛋白互作综合得分>0.4作为筛选条件从而得到靶点的PPI信息，最后将得到的PPI信息导入Cytoscape软件，得到PPI网络图。

1.4靶点基因本体论(gene ontology,GO)和KEGG通路富集分析 运用R语言，利用bioconductor数据库对得到的共同靶点进行GO和KEGG富集分析，保留P≤0.05的结果，得到GO及KEGG信号通路柱状图、气泡图，并获取靶点-信号通路网络图，进一步说明靶点和信号通路在七味都气丸治疗COPD的作用。

1.5靶点-信号通路网络构建 运用Cytoscape软件，将靶点信息及KEGG富集所得到的的通路信息导入，进行网络构建，得到靶点与信号通路之间的网络图。

2 结 果

2.1方剂的中药成分筛选 筛选最后得到81个有效成分，其中熟地2个，五味子8个，山药16个，茯苓15个，丹皮11个，泽泻10个，山萸肉20个。

2.2疾病相关的中药活性成分靶点筛选 得到中药中活性成分相关靶点共287个，排除重复之后共得到相关靶点102个。利用Gene Cards数据库对COPD相关靶点筛选，得到疾病相关靶点5 971个。运用R语言得到药物与疾病的靶点交集共89个，见表1；绘制韦恩图，见图1。

图1 七味都气丸与慢性阻塞性肺疾病重合的靶点韦恩图

表1 七味都气丸与慢性阻塞性肺疾病交集靶点

2.3中药-化合物-靶点-疾病网络构建 根据组成复方的中药、化合物、核心靶点以及疾病信息，运用Cytoscape软件构建七味都气丸的“中药-化合物-靶点-疾病”的网络构建图(图2)。图中正六边形代表七味都气丸方中的7味中药，浅蓝色代表七味都气丸治疗COPD的化合物，浅绿色代表七味都气丸治疗COPD的核心靶点，深绿色代表COPD。图中包含175个节点，449条边，通过对网络分析得知，按照degree度值排序，其中排在第一位的化合物为槲皮素(quercetin)，其次依次是豆甾醇(Stigmasterol)、山柰酚(kaempferol)、β-谷固醇(beta-sitosterol)、谷甾醇(sitosterol)、四氢鸭脚木碱(Tetrahydroalstonine)、海风藤酮(Kadsurenone)、薯蓣皂苷配基(diosgenin)、常春藤皂苷元(hederagenin)。前十位基因依次是NCOA2、PGR、NR3C2、PTGS1、CHRM1、GABRA1、CHRM3、CHRM2、AR、PRSS1。并且各个靶点连接多种不同的化合物，说明七味都气丸中的化合物是通过这些靶点来调控疾病的，可以得出中药复方通过多靶点-多化合物共同调控整个疾病的治疗过程。

图2 七味都气丸的中药-化合物-靶点-疾病网络

2.4PPI构建 运用String数据库，将药物与疾病相同基因导入，生物筛选条件选择人类(Homo sapiens)，经过设置，隐藏游离的点位，剩余87个蛋白，其蛋白互作关系如图3。再运用Cytoscape软件对图3进行处理，将蛋白根据degree值大小进行处理，degree值越大，其图形越大颜色也就越深，这样能更明显地看出各蛋白之间的互作关系，如图4。最后，运用R语言对各蛋白进行排序，取前20位，如图5。与各项密切相关的是IL6，有54个互作关系，其次依

图3 七味都气丸与慢性阻塞性肺疾病蛋白互作网络1

图4 七味都气丸与慢性阻塞性肺疾病核心网络构建2

图5 七味都气丸与慢性阻塞性肺疾病核心网络靶点3

次为CASP3、VEGFA、MAPK8、EGFR、MYC、ESR1、CCND1、FOS、AR、ERBB2、MTOR、PPARG、RELA、PGR、NOS3、HIF1A、NR3C1、CAV1、AHR。

2.5GO富集及KEGG通路分析

2.5.1GO富集分析 共得到112个生物过程，按生物过程中包含基因数及padjust值为标准，经R语言以筛选取前20位制作点状图(见图6)，其分为生物过程(BP)、细胞组成(CC)、分子功能(MF)3个方面，分别是DNA结合转录激活剂活性，RNA聚合酶Ⅱ特异性(DNA-binding transcription activator activity, RNA polymerase Ⅱ-specific)；泛素样蛋白连接酶结合(ubiquitin-like protein ligase binding)；泛素蛋白连接酶结合(ubiquitin protein ligase binding)；RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合(RNA polymerase Ⅱ transcription factor binding)；核受体活性(nuclear receptor activity)；转录因子活性，直接的配体调节序列特异性DNA结合(transcription factor activity, direct ligand regulated sequence-specific DNA binding)；类固醇激素受体活性(steroid hormone receptor activity)；类固醇结合(steroid binding)；核激素受体结合(nuclear hormone receptor binding)；氧化还原酶活性，作用于成对的供体上，并结合或还原分子氧(oxidoreductase activity, acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen)；G蛋白耦联的胺受体活性(G protein-coupled amine receptor activity)；激活转录因子结合(activating transcription factor binding)；激素结合(hormone binding)；神经递质受体活性(neurotransmitter receptor activity)；乙酰胆碱受体活性(acetylcholine receptor activity)；G蛋白耦联的血清素受体活性(G protein-coupled serotonin receptor activity)；血清素受体活性(serotonin receptor activity)；谷胱甘肽结合(glutathione binding)；寡肽结合(oligopeptide binding)；氧化还原酶活性，以NAD(P)H，血红素蛋白为受体起作用(oxidoreductase activity, acting on NAD(P)H, heme protein as acceptor)。

图6 七味都气丸中治疗慢性阻塞性肺疾病的靶点GO富集点状图

2.5.2KEGG通路分析 共得到122个富集信息，包含疾病、炎症信号通路、病毒感染通路、免疫信号通路、代谢过程等，以P<0.05，count值为标准，取前20位，制作柱状图见图7。具体过程包括：PI3K-Akt 信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)；卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)；人巨细胞病毒感染(Human cytomegalovirus infection)；流体剪切应力与动脉粥样硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)；乙型肝炎(Hepatitis B)；癌症相关蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)；前列腺癌(Prostate cancer)；肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma)；细胞凋亡(Apoptosis)；乳腺癌(Breast cancer)；大肠癌(Colorectal cancer)；糖尿病并发症相关的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)；TNF信号通路(TNF signaling pathway)；甲状腺激素信号通路(Thyroid hormone signaling pathway)；胰腺癌(Pancreatic cancer)；内分泌抵抗(Endocrine resistance)；HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)；铂耐药(Platinum drug resistance)；EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)；膀胱癌(Bladder cancer)；本研究共得出信号通路39条，除此之外，还有IL-17 signaling pathway；C-type lectin receptor signaling pathway；T cell receptor signaling pathway；MAPK signaling pathway等比较重要的信号通路。

图7 七味都气丸中治疗慢性阻塞性肺疾病的靶点KEGG 柱状图

2.5.3靶点-信号通路网络图 将靶点信息及39条通路信息导入Cytoscape软件进行网络图绘制，蓝色正六边形为信号通路，黄色圆形为靶点信息，以degree值为标准，值越大说明两者关系越紧密，图形形状越大。见图8。其核心靶点为RAF1、RELA、MAPK8、IKBKB、PRKCA、NFKBIA、GSK3B、EGFR、CCND1、FOS、BCL2、IL-6等。

图8 七味都气丸中治疗慢性阻塞性肺疾病的靶点-信号通路网络图

3 讨 论

七味都气丸中的有效成分以degree度值排序，从高到低依次为：槲皮素(quercetin)、豆甾醇(Stigmasterol)、山柰酚(kaempferol)、β-谷固醇(beta-sitosterol)、谷甾醇(sitosterol)、四氢鸭脚木碱(Tetrahydroalstonine)、海风藤酮(Kadsurenone)、薯蓣皂苷配基(diosgenin)、常春藤皂苷元(hederagenin)。槲皮素是广泛存在于自然界的黄酮类化合物，目前被证实其具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤、抗氧化及清除自由基等作用[3]。有研究表明，槲皮素可通过降低IL-6水平，降低小气道及肺组织结构被破坏从而导致肺功能下降的风险。同时，其还可以改善胰岛素抵抗，降低体内三酰甘油及TNF-α、IL-8等炎症因子的水平，从而降糖、降脂、降低炎症因子分泌水平[4]。山柰酚与槲皮素同属自然界的黄酮类化合物，其作用与槲皮素较为相似，可显著降低肺泡灌洗液中炎症细胞的数量[5]，且会显著改善肺泡充血及肺组织白细胞浸润等急性肺损伤的病理特征[6]。豆甾醇、谷甾醇、β-谷固醇均归属于类固醇范畴，这类化合物不仅可以调节胆固醇含量，并且具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节等作用[7]，还可以降低TNF-α和pNF-κB表达，从而抑制肺纤维化的发生[8]。

从PPI网络中可以得出，IL-6在其网络中发挥重要作用，其次是CASP3、VEGFA、MAPK8、EGFR、MYC。IL-6是一种炎症因子指标，IL-6可通过影响气道重塑功能，从而加重COPD的病情；且IL-6是COPD急性加重的重要危险因素，COPD稳定期患者IL-6水平升高会增加急性发作的风险[9]。刘温娟等[10]研究证实IL-6在COPD全身炎症反应中起到了介导的作用，并且其在COPD合并肺动脉高压的发生、发展过程中起到了重要作用。CASP3是检测细胞凋亡的一项指标，其水平可评价药物对细胞凋亡的影响。血管内皮生长因子A(VEGFA)是一种影响血管重塑及增长的因子，VEGFA在COPD急性加重期可见明显升高，可被视为急性发作期的血清标志物之一[11]。VEGFA主要通过调节内皮细胞的增殖，并增加微血管通透性，从而诱导血管生长[12]。丝裂原活化蛋白激酶8(MAKP8)可调控细胞的分化、生长、增殖各个阶段，并对免疫功能进行调控。表皮生长因子受体(EGFR)在细胞生理活动中发挥重要的调节作用，EGFR与气道黏液高分泌相关，抑制EGFR的表达可降低COPD的气道黏液高分泌[13]。Myc是一种原癌基因，其参与了成纤维细胞的分化增殖，并导致瘢痕的增生，从而影响气道重塑[14-15]。

根据GO富集分析结果得知，七味都气丸主要通过调节DNA结合转录激活剂，核受体、转录因子、类固醇激素受体等活性及连接泛素样蛋白连接酶、泛素蛋白连接酶、RNA聚合酶Ⅱ、核激素受体等受体表达而恢复呼吸系统的生理活动。

通过KEGG通路分析结果可以看出，七味都气丸治疗COPD主要是通过PI3K-Akt信号通路、细胞凋亡、TNF信号通路、甲状腺激素信号通路、相关病毒感染、相关疾病等生理过程来发挥治疗作用的。以PI3K-Akt信号通路为例，该通路可在气道慢性炎症中通过对炎症介质释放、炎症细胞的活化及气道重塑等功能的调控，从而发挥重要的作用[16-17]。COPD的炎症反应过程中，PI3K参与了其炎症细胞的活化与聚集，而过量的炎症细胞导致气道收缩及重塑，并通过产生的多种蛋白酶对肺实质产生损害，导致肺水肿的发生[18]。一项实验研究表明，抗氧化物质可以通过抑制PI3K-Akt通路及其相应的节点物质，从而抑制气道炎症的发生[19]。COPD患者应用糖皮质激素治疗时效果时常不理想，远不如哮喘及风湿性关节炎等疗效明显，故存在一定的糖皮质激素抵抗存在，而糖皮质激素抵抗与HDAC2活性减弱有关，而HDAC2活性减弱又一定程度上受到PI3K-Akt信号上调的影响[20-22]。故目前PI3K抑制剂药物研究已成为热点，可通过抑制PI3K-Akt通路从而减轻气道炎症程度及糖皮质激素抵抗水平，这也成为中药复方治疗COPD的靶向研究的一条重要路径。

从靶点与信号通路网络图中得知，RAF1、RELA、MAPK8、IKBKB、PRKCA、NFKBIA、GSK3B、EGFR、CCND1、FOS、BCL2、IL6等作为七味都气丸治疗COPD的核心靶点，在相应的信号通路上发挥着重要的作用。RAF1、RELA、IKBKB、GSK3B、EGFR、CCND1均位于PI3K-Akt 信号通路(hsa04151)上发挥作用。

综上所述，七味都气丸作为治疗喘病肺肾气虚证的经典方剂，临床上用于治疗COPD效果显著，本研究应用网络药理学方法并检索复方与疾病的相关靶点，得出共有靶点89个，再通过中药-化合物-靶点-疾病网络构建、PPI蛋白互作、GO富集及KEGG通路分析可以预测出：七味都气丸通过其中的有效活性成分槲皮素、豆甾醇、山柰酚、β-谷固醇、谷甾醇等，并通过RAF1、RELA、MAPK8、IKBKB、PRKCA、IL6等靶点，调控PI3K-Akt、TNF等相关信号通路及细胞凋亡等生理过程，从而减轻气道炎症、调节免疫功能、降低对肺实质的损害，来达到治疗COPD的目的。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。