理冲生髓饮有效组分调控炎性因子对卵巢癌侵袭转移影响的研究

郭 滢,刘逸超,左冬冬,韩凤娟

(1. 黑龙江中医药大学博士后流动站，黑龙江 哈尔滨 150040； 2. 黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；3. 哈尔滨工业大学医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤，致死率高。由于卵巢癌早期缺乏典型症状，且转移快，易产生耐药性，这些特点使其成为卵巢癌致死率高的重要原因[1-2]。19世纪德国病理学家提出肿瘤起源于慢性炎症这一假说，炎性因子的上调能够激活转移通路的传导，进而促进肿瘤细胞的迁移、侵袭和上皮间质转化(EMT)[3]。此外，肿瘤细胞的特异性、免疫细胞之间的动态联系均影响肿瘤的发展，也是当前研究的靶点。前期研究显示中药复方理冲生髓饮一方面能够减轻卵巢癌患者临床放化疗后的毒副作用，增强机体免疫力；另一方面能通过影响基因靶点信号通路等对SKOV3细胞的增殖产生抑制作用[4-6]。本实验主要通过观察卵巢癌微环境中炎性因子的改变，进一步探讨理冲生髓饮有效组分对卵巢癌侵袭转移的影响及其相关炎性调控机制，为理冲生髓饮治疗卵巢癌提供新的靶点、研究思路以及理论基础。

1 实验材料与方法

1.1细胞 人卵巢癌SKOV3细胞，购于齐氏生物科技有限公司。

1.2药物 理冲生髓饮组方：人参、黄芪、鹿角霜、仙灵脾、水蛭、浙贝母、莪术、三棱，各药材购于黑龙江中医药大学附属第一医院门诊药剂科。贝伐单抗(瑞士罗氏制药公司)。

1.3试剂及仪器 PRMI-1640(HyClone)，胎牛血清(HyClone)，二甲基亚砜(DMSO，上海慧颖生物技术有限公司)，超净工作台(Hettich)，CO2培养箱(Heal Force)，96孔细胞培养板(美国Corning公司)，酶标分析仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司)。血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)检测试剂盒[爱必信(上海)生物科技有限公司]。

1.4含药血清制备 取32只健康SPF级雄性大鼠，4～5周龄，体重(200±20)g，购自黑龙江中医药大学，动物合格证号：230731211100000984。置笼中自由饮食喂养1周后随机分为空白组、生髓饮低剂量组、生髓饮中剂量组和生髓饮高剂量组，每组8只。生髓饮低、中、高剂量组分别给予3.76 g/(kg·d)、7.52 g/(kg·d)、11.28 g/(kg·d)理冲生髓饮灌胃，空白组给予同体积蒸馏水灌胃，均2次/d，连续7 d。末次灌胃结束2 h后眼眶取血，于室温下静置30 min，离心获取血清，无菌条件下过滤2次，56 ℃恒温水浴锅灭活30 min，经0.22 μm微孔滤膜滤过除菌，分装于1 mL/支的冻存管内，保存至-20 ℃冰箱，以备后续实验使用。

1.5检测指标和方法

1.5.1鸡胚绒毛尿囊膜血管生成情况 选择重量(65±10)g、蛋壳无破损的新鲜种蛋60枚，将其随机分为空白组、生髓饮低剂量含药血清组、生髓饮中剂量含药血清组、生髓饮高剂量含药血清组和贝伐单抗组，每组12枚。放置在(38±0.5)℃的生化培养箱中培养，制备鸡胚绒毛尿囊膜模型，在相对湿度65%～70%环境中孵育，每日早晚各翻转1次，第3天起于检卵灯下观察种蛋发育情况，取第7天发育的鸡胚，置于检卵灯下画出气室和胚头位置，在胚头右下方的0.5～1.0 cm处，划定直径约1.5 cm的开窗位置；用砂轮在蛋壳表面小心磨划出直径1.5 cm的凹痕，用眼科镊轻轻揭除开窗处卵壳及白色卵壳膜，暴露出鸡胚绒毛尿囊膜。通过显微镜观察以微孔滤膜载体为中心发出的血管(包括毛细血管、小动脉、小静脉在内的凡属趋向性生长的血管)，将血管主干评价为一级血管，从主干分支出来的血管评价为二级血管，分别计数，取平均值。

1.5.2MTT法检测SKOV3细胞增殖情况 选取培养至对数生长期的人卵巢癌SKOV3细胞，分为空白组、生髓饮低剂量含药血清组、生髓饮中剂量含药血清组、生髓饮高剂量含药血清组和贝伐单抗组，调整细胞数目为1×106个/L，接种至24孔板，空白组外加入生理盐水培养，生髓饮各组分别加入相应浓度的理冲生髓饮含药血清及5 mg/L贝伐单抗培养，分别于培养24 h、48 h后固定，染色，在荧光显微镜下观察，随机选取5个清晰视野统计凋亡细胞数目及总细胞数目，计算凋亡率(抑制率)= 视野内凋亡细胞数/细胞内视野总数×100% 。

1.5.3划痕实验(迁移实验)检测SKOV3细胞迁移情况 实验分组同“1.5.2”，每组3个复孔，每孔给予相应培养基培养48 h，将处理后的SKOV3细胞接种于6孔板上，当细胞铺满整个板底后，用200 μL枪头的移液枪在板面上横线划痕，继续培养24 h后观察划痕修复情况，拍照对比,结果计算公式：伤口愈合率(%)=(A-B)/A×100%，A为起始时间的划痕宽度，B为观察时的划痕宽度。

1.5.4Transwell小室实验检测SKOV3细胞侵袭情况 实验分组同“1.5.2”，各组给予相应培养24 h ，应用0.25%胰酶常规消化细胞，终止消化后将其离心，弃去上清液，加入无血清培养基重悬细胞，密切观察卵巢癌SKOV3细胞生长程度，当计数为5×104个细胞时，接种在 Transwell小室的上室，将上室加入200 μL的无血清培养基，下室加入500 μL含 10%FBS 的培养基，随后Transwell小室轻轻置于24孔板中，收集培养处理后的SKOV3细胞，配制成1×105个/mL的单细胞悬液，铺板于Transwell小室内，培养24 h，PBS淋洗后，用棉签轻柔擦去上层未穿膜的细胞和角质胶，固定，染色，在光学显微镜下随机选择5个高倍镜，记录每个视野的平均穿膜细胞数,采用平均计数法对比每个高倍镜下细胞数量作为对比。

1.5.5SKOV3细胞上清液中炎性因子水平检测 实验分组同“1.5.2”，各组给予相应培养24 h后，弃去孔内上清液， 采用ELISA试剂盒，按照说明书操作检测VEGF、MMP-9、IL-6 、IL-1 、TNF-α水平。

2 结 果

2.1鸡胚绒毛尿囊膜血管生成情况 解剖显微镜下观察，空白组血管形成正常，呈叶脉样、放射状生长，脉络清晰，主血管管径粗壮，长势旺盛，且建立侧支循环；生髓饮各含药血清组及贝伐单抗组血管受损变细，新生血管受抑制，甚至血管分支多处断裂或完全消失，一级和二级血管数目均明显少于空白组(P均<0. 05)，且生髓饮中剂量含药血清组和贝伐单抗组均明显少于生髓饮低、高剂量含药血清组(P均<0. 05)。见图1及表1。

表1 各组鸡胚绒毛尿囊膜新生血管数比较条)

图1 解剖显微镜下各组鸡胚绒毛尿囊膜血管生成情况

2.2SKOV3细胞增殖抑制率 培养24 h、48 h后，生髓饮中、高剂量含药血清组SKOV3细胞增殖抑制率均明显高于生髓饮低剂量含药血清组(P均<0.05),生髓饮低、中剂量含药血清组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 各组培养24 h、48 h后SKOV3细胞增殖抑制率比较

2.3SKOV3细胞迁移及侵袭转移情况 作用24 h后，空白组的划痕几乎完全愈合，生髓饮高剂量含药血清组和贝伐单抗组的细胞划痕愈合速度减慢，见图2；Transwell小室结果显示空白组SKOV3细胞被染色面积大，迁移细胞数目显著增多，生髓饮各含药血清组和贝伐单抗组SKOV3细胞迁移细胞数目明显减少，见图3。与空白组比较，生髓饮各含药血清组及贝伐单抗组 SKOV3细胞迁移率和侵袭率均显著降低，且生髓饮中、高剂量含药血清组和贝伐单抗组均显著低于生髓饮低剂量含药血清组，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表3。

表3 各组SKOV3细胞迁移及侵袭情况比较

图2 划痕实验各组SKOV3细胞迁移情况

图3 Transwell小室实验各组SKOV3细胞侵袭情况

2.4SKOV3细胞中相关因子表达情况 生髓饮各含药血清组及贝伐单抗组VEGF、IL-6 、TNF-α水平及生髓饮高剂量含药血清组、贝伐单抗组IL-1水平均明显低于空白组(P均<0.05) ；生髓饮高剂量含药血清组和贝伐单抗组VEGF、IL-6 、TNF-α水平均明显低于生髓饮中、低剂量含药血清组(P均<0.05)，生髓饮高剂量含药血清组VEGF、IL-1、TNF-α水平与贝伐单抗组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，各组MMP-9水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图4。

图4 各组SKOV3细胞上清液中VEGF、MMP-9、IL-6 、IL-1 、TNF-α水平

3 讨 论

目前卵巢癌的发病病因尚不明确，比较公认的有遗传因素、环境因素、饮食因素等。卵巢癌的侵袭和转移是导致卵巢癌预后不良的主要因素之一，而肿瘤的侵袭和转移是一个复杂的生物学过程。现代研究显示，肿瘤可通过多途径诱导新生血管生成，其中VEGF能够影响肿瘤细胞的侵袭，为其转移建立通道，并抑制免疫细胞的增殖，导致T细胞敏感性减弱，诱导T细胞死亡，免疫机制失衡，最终导致卵巢癌发生侵袭和转移[7]。

卵巢癌病灶处于盆底最深处，其内部形成了一个由多种促炎因子和化学因子构成的微环境。现代研究显示，炎性微环境以及炎性因子的刺激能够导致卵巢癌的发生以及发展[8]；经输卵管逆行的子宫内膜能够在卵巢周围形成炎性微环境，这可能与卵巢癌的发生关系密切[9-10]。免疫机制和肿瘤的关系是近几年的研究热点，炎症介质和免疫细胞产生的相关因子TNF-α、IL-1β等与卵巢癌的发生发展密切相关[11]。TNF-α、IL-1β的释放会导致不同细胞因子和趋化因子的释放，进一步增强炎性反应，在局部产生更多的免疫细胞，提高局部组织的侵袭能力和血管生成能力，加速肿瘤的进展[12-13]。课题组前期研究过程中发现，相关炎性因子能够导致卵巢癌的侵袭和转移，故本实验重点探讨了炎性因子对卵巢癌侵袭转移的影响。

对于肿瘤的治疗，不能局限于增殖的肿瘤细胞，整体治疗会取得更好的疗效，这与中医药的整体治疗观不谋而合。理冲生髓饮组方是以“温煦肾阳，搜剔胞络瘀滞”为理论依据，在经方“理冲汤”的基础上进行加减而成。温煦肾阳能够使人体的全身阳气充沛，增强机体搜剔胞络瘀滞之力，达到活血化瘀消癥的目的。卵巢癌的发病主要由阳气主导，机体肾阳虚，命门火衰，阴寒内盛，冲任不得肾阳温煦，胞宫亦不得煦，虚寒内生，而致寒凝血滞，日久聚生癥瘕，结于生殖之所，终致本病。鉴于此，组方理冲生髓饮，以补虚消瘀。

本研究结果显示，鸡胚绒毛尿囊膜实验发现生髓饮各含药血清组血管受损变细，新生血管受抑制，甚至血管分支多处断裂或完全消失，说明理冲生髓饮能够抑制新生血管；划痕实验和小室侵袭实验显示生髓饮各含药血清组卵巢癌细胞侵袭速度变慢，转移的卵巢癌细胞数量明显减少，说明理冲生髓饮能够抑制巢癌细胞侵袭转移；生髓饮各含药血清组VEGF、IL-6 、TNF-α水平及生髓饮高剂量含药血清组IL-1水平均明显降低，说明理冲生髓饮能够抑制卵巢癌的血管生成，能够调控TNF-α、IL-6等炎性因子水平，抑制炎症反应。

综上所述，肿瘤炎性微环境贯穿于疾病的发生发展过程中，理冲生髓饮有效组分可能通过抑制相关炎性因子的表达、影响肿瘤周围的炎性微环境而抑制卵巢癌SKOV3细胞的侵袭转移，为靶向治疗肿瘤奠定了新的理论基础，为今后研究理冲生髓饮对卵巢癌的抑制作用提供了理论基础。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。