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母源性甲亢对仔鼠肝脏Caspase-3和Bcl-2表达的影响研究

2021-11-17刘志红王瑞英

现代中西医结合杂志 2021年32期
关键词:甲亢低剂量肝脏

刘志红,鲁 明,刘 静,王 芳,王瑞英

(1. 河北医科大学第二医院,河北 石家庄 050000;2. 邢台市人民医院,河北 邢台 054031)

随着人们对优生优育认识的加深,产前检查越来越得到重视,随之妊娠期甲状腺疾病的检出率增高。未治疗的甲状腺疾病会导致妊娠高血压、妊娠相关心力衰竭、自发性流产、死产、胎儿宫内生长受限等[1-2],且胎儿可能受到母体甲状腺刺激抗体或抑制抗体的影响而发生甲状腺功能异常[3],因此对孕妇甲状腺疾病的及时识别和充分管理至关重要。目前研究发现,新诊断的甲状腺功能亢进(简称甲亢)患者肝功能损伤的患病率在15%~76%[4],引起甲亢患者肝脏异常的机制可能是代谢率增高导致的耗氧量增加,导致肝脏静脉周围区域相对缺氧,进而导致细胞凋亡和氧化应激[5]。目前对于母体甲亢时对子代肝脏损伤的影响研究报道较少,因此本研究观察了母源性甲亢对不同生长发育期仔鼠甲状腺功能及肝组织中Caspase-3、Bcl-2表达的影响,以明确母源性甲亢是否对仔鼠肝脏有影响,并探讨其可能机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 成年8周龄SD雌性大鼠36只,雄性大鼠18只,体重(200±10)g,购于河北医科大学实验动物中心,合格证编号:1103121。大鼠饲养于室温22~24 ℃、相对湿度 50%~70%环境下,每日12 h日光灯循环照明,自由饮食饮水。

1.2主要试剂及实验设备 Caspase-3兔抗多克隆抗体、Bcl-2兔抗多克隆抗体、鼠抗β-actin单克隆抗体(美国Santa Cruze公司),血清促甲状腺激素(TSH)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)试剂盒(Siemens Healthcare公司),左甲状腺素钠片(德国默克雪兰诺公司),蛋白浓度测定(BCA)试剂盒(上海申能博彩生物科技公司),4×蛋白质上样缓冲液(北京索莱宝科技有限公司),EBA12R型低温离心机(德国Hettich公司),DYY-III型稳压稳流电泳仪(中国北京六一仪器厂),GDS8000凝胶成像仪(美国UVP公司)。

1.3实验方法 动物适应环境饮食情况1周后,将雌鼠随机分为对照组、低剂量左甲状腺素钠组、高剂量左甲状腺素钠组各12只。低剂量左甲状腺素钠组给予左甲状腺素钠生理盐水混悬液50 μg/100 g灌胃,高剂量左甲状腺素钠组给予左甲状腺素钠生理盐水混悬液150 μg/100 g灌胃,对照组给予等剂量的生理盐水灌胃,均1次/d,每3 d称量体重1次,根据体重调节药物量。低、高剂量左甲状腺素钠组发现大鼠出现多食易激惹等甲亢症状时,采集尾静脉血检测大鼠甲状腺功能,确定甲亢后,雌雄大鼠合笼(对照组合笼时间与给药组相同),次日发现阴栓为受孕,然后继续灌胃至分娩。

1.4样本获取 分别取每组中出生当天及出生21 d、60 d雌鼠所产雄性仔鼠各10只,禁食不禁水12 h后,1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,摘取一侧眼球取血(出生当天小鼠血清太少,不取血),3 000 r/min 快速离心10 min,取上清液,分装冷冻保存待检测;分离肝脏组织,分装后存放于-80 ℃冰箱用于后续实验。

1.5观测指标与方法

1.5.1血清甲状腺功能指标 取冷冻的血清4 ℃过夜,置于室温融化后,参照试剂盒说明书,使用全自动生化仪检测血清FT3、FT4、TSH水平。

1.5.2肝组织中Caspase-3和Bcl-2蛋白表达情况 采用Western blot法检测:取肝脏组织0.33 g,加入 520 μL蛋白裂解液中放入进行匀浆(RIPA∶PMSF=100∶1),时间为6 min,2 000 r/min离心,吸取上清液保存于EP管内,-80 ℃储存。采用改良Lowry法进行蛋白质定量,测样品的蛋白浓度。行SDS-PAGE凝胶电泳,转膜,5%脱脂奶粉封闭2 h,分别加Caspase-3兔抗多克隆抗体(1∶700)、Bcl-2兔抗多克隆抗体(1∶500),在室温下放置30 min,然后4 ℃冰箱过夜,辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG和抗小鼠IgG用PBS液分别稀释到1∶15 000和1∶10 000,室温孵育2 h,ECL显影。用分析软件分析每个条带的吸光度值,以目的蛋白丰度/β-actin蛋白吸光度比值表示相对表达量。

2 结 果

2.1各组仔鼠甲状腺功能比较 低、高剂量左甲状腺素钠组仔鼠出生21 d的血清FT3、 FT4水平均明显高于对照组(P均<0.05), TSH水平均明显低于对照组(P均<0.05),且高剂量左甲状腺素钠组血清FT3、 FT4水平均明显高于低剂量左甲状腺素钠组(P均<0.05),TSH水平明显低于低剂量左甲状腺素钠组(P<0.05);高剂量左甲状腺素钠组仔鼠出生60 d的血清FT3、 FT4水平均明显高于对照组和低剂量左甲状腺素钠组(P均<0.05), TSH水平均明显低于对照组和低剂量左甲状腺素钠组(P均<0.05),低剂量左甲状腺素钠组各指标和对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组仔鼠出生后各时间点甲状腺功能比较

2.2各组仔鼠肝脏组织中Caspase-3和Bcl-2蛋白表达情况 低剂量左甲状腺素钠组仔鼠出生21 d的Caspase-3蛋白相对表达量明显高于对照组(P<0.05),Bcl-2蛋白相对表达量明显低于对照组(P<0.05);高剂量左甲状腺素钠组仔鼠出生当天、21 d、60 d的Caspase-3蛋白相对表达量均明显高于同期对照组和低剂量左甲状腺素钠组(P均<0.05),Bcl-2蛋白相对表达量均明显低于同期对照组和低剂量左甲状腺素钠组(P均<0.05)。见表2及图1。

表2 各组仔鼠出生后各时间点肝脏组织中Caspase-3、Bcl-2蛋白相对表达量比较

3 讨 论

正常人机体内甲状腺激素维持着人体正常生长发育、代谢、体温调节等[6-7],而甲亢患者甲状腺激素分泌异常,可以引发骨质疏松、心力衰竭、肝损伤等并发症[8-10]。甲亢患者肝损伤的发生一方面可能由肝脏需降解过多的甲状腺素导致负荷增加,对肝脏产生毒性作用引起,另一方面可能为甲亢时肝脏各种代谢活跃,自由基生成增加,氧化应激反应导致肝细胞损伤[11]。相关实验研究发现,甲亢时肝脏细胞凋亡增加,这与脂质过氧化导致的细胞膜损伤有关[12-13]。

A为对照组出生当天;B为对照组出生60 d;C为对照组出生21 d;D为低剂量左甲状腺素钠组出生当天;E为低剂量左甲状腺素钠组出生60 d;F为低剂量左甲状腺素钠组出生21 d;G为高剂量左甲状腺素钠组出生当天;H为高剂量左甲状腺素钠组出生60 d;I为高剂量左甲状腺素钠组出生21 d

在多细胞生物的生长、发育、存活以及死亡等过程中,都伴随着细胞凋亡的过程[14]。Caspase是天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶,是哺乳动物凋亡机制中的关键因素,能够激活凋亡信号通路,使细胞皱缩,导致细胞凋亡[15]。Caspase-3处于蛋白酶级联切割过程中的核心位置,是细胞凋亡的执行者[16]。Bcl-2家族是细胞凋亡的另一重要组成部分,在Bcl-2家族内,最明星的两个分子是Bcl-2分子和Bax分子[17]。当细胞内Bax高表达时,细胞对死亡信号敏感,促进细胞发生凋亡;当Bcl-2高表达时,Bcl-2可以和Bax形成异源二聚体,抑制细胞凋亡。Bcl-2表达量增加可引起从线粒体释放的凋亡诱导因子和细胞色素C减少,进一步抑制Caspase-3的激活,从而抑制细胞凋亡[18]。

在妊娠早期,母体甲状腺激素可通过胎盘转运至胎儿,因此胎儿甲状腺功能受母体甲状腺功能的影响[19]。本实验结果显示,低、高剂量左甲状腺素钠组仔鼠出生21 d的血清FT3、FT4水平均明显升高,TSH水平均明显降低;低剂量左甲状腺素钠组仔鼠出生60 d时甲状腺功能各指标接近正常,但高剂量左甲状腺素钠组仔鼠各指标仍明显异常。低剂量左甲状腺素钠组仔鼠出生21 d的Caspase-3蛋白相对表达量均明显升高,Bcl-2蛋白相对表达量明显降低,出生当天和出生60 d与对照组接近;高剂量左甲状腺素钠组仔鼠出生当天、21 d、60 d的Caspase-3蛋白相对表达量均明显高于同期对照组和低剂量左甲状腺素钠组,Bcl-2蛋白相对表达量均明显低于同期对照组和低剂量左甲状腺素钠组。出现这种变化,笔者认为可能是出生当天低剂量左甲状腺素钠组仔鼠自身甲状腺功能可能受母体影响较高剂量左甲状腺素钠组轻,所以肝脏细胞凋亡相关因子表达异常不明显;出生21 d时,随着过量甲状腺激素在体内作用,低、高剂量左甲状腺素钠组仔鼠自身甲状腺功能明显异常,均出现细胞凋亡相关因子表达异常;出生60 d时,随着下丘脑-垂体-甲状腺轴的自身调节作用,低剂量左甲状腺素钠组甲状腺激素水平和细胞凋亡相关因子表达逐渐恢复正常,而高剂量左甲状腺素钠组因甲状腺异常严重已无法自我恢复,故细胞凋亡相关因子表达仍异常,会促进肝脏细胞凋亡。

综上所述,母源性甲亢对仔鼠甲状腺功能和肝脏中细胞凋亡相关因子表达有明显影响,其中低剂量左甲状腺素钠造成的母体甲亢对后代甲状腺功能的影响较轻微,随着仔鼠的生长发育,自身免疫调节系统逐渐完善,甲状腺功能和肝细胞凋亡相关因子表达可恢复正常;但重度甲亢母鼠对仔鼠甲状腺功能、肝脏的影响较为严重,且这种影响随着后代的生长发育改善不明显。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。

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