碱胁迫下冰草根系pH值与有机酸含量变化

柯 梅，侯钰荣，张一弓

(1.新疆畜牧科学院草业研究所，乌鲁木齐 830000；2.新疆大学生命科学与技术学院/新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐 830046)

0 引 言

【研究意义】世界盐渍土面积约为9.54×108hm2，占全球陆地面积的7%[1-2]。我国盐渍土面积约3 600×104hm2，占我国可利用土地面积的4.88%，主要集中于西部六省区(陕、甘、宁、青、蒙、新)，占全国盐渍土面积的69%[3-4]。土壤盐渍化不仅直接危害植物生长，导致农业减产、荒漠化加剧，还会提高土壤重金属迁移能力，增加土壤重金属污染程度，严重降低土地利用率。【前人研究进展】土壤盐碱化主要是指以NaCl、Na2SO4为主的中性盐和以Na2CO3、NaHCO3为主的碱性盐对植物造成的胁迫[5]，二者对作物的危害机制既有相似也有不同，认识植物对盐碱胁迫的反应，是判断植物耐盐碱性的重要基础[6]。盐碱胁迫会损伤植物的膜系统，使植物发生生理干旱、离子毒害、渗透胁迫，危害植物的生长、发育、产量及品质，严重时甚至会使植物死亡[7]。碱胁迫相比于盐胁迫，除了具有渗透胁迫和离子毒害之外还具有高pH胁迫[8]，高pH伤害植物根系的生长，影响植物矿质元素吸收，干扰离子稳态，破坏植物体内的稳定性，干扰或改变植物的各种代谢活动[9]。植物作为固着生物经常会受到包括盐碱胁迫在内的各种逆境胁迫[10]，植物为了更好适应逆境环境，会发生许多内在的生理生化反应，其中就包括根系分泌物种类和含量的变化[11-12]。植物根系分泌物中存在大量的H+和低分子量有机酸[13-14]，会降低土壤pH值，调节根系周围土壤环境的酸碱平衡。研究表明，在高盐胁迫下植物体会通过积累和分泌有机酸进行渗透调节[15]，不同的植物在受到盐胁迫时积累的有机酸种类各异[16]。目前已知的植物根系分泌物的有机酸，包括酒石酸、草酸、柠檬酸、苹果酸、甲酸、琥珀酸[17]等。【本研究切入点】目前，针对逆境胁迫下植物体有机酸分泌机制已开展了部分研究，分析耐盐碱植物根系有机酸分泌积累特性，是揭示耐盐碱植物抗逆机制的一种有效途径[18]。塔乌库姆冰草(AgropyroncristatumTawukumu)为禾本科冰草属多年生草本植物，是刈割-放牧兼用型草原良种，具有抗旱、耐寒，栽培生态幅度宽、生育期短、高产、营养丰富、适口性好、饲用价值高等优良特性[19-20]。张一弓等[20]对塔乌库姆冰草在不同碱胁迫条件下的发芽情况和生理指标研究发现，其对碱胁迫(Na2CO3和NaHCO3)具有一定的耐受性，在胁迫浓度≤30 mmol/L即pH≤9.1时，萌发和生长不受影响；当胁迫浓度≥90 mmol/L即pH≥10.1时，萌发和生长会受到明显抑制；碱胁迫浓度≤60 mmol/L即pH≤9.8时，是塔乌库姆冰草能够萌发和生长的最大耐碱性范围。【拟解决的关键问题】研究设2种碱性盐(Na2CO3和NaHCO3)处理，研究塔乌库姆冰草耐碱性机理，分析根系分泌的有机酸与pH值在调控植物抗碱性之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料塔乌库姆冰草由新疆畜牧科学院草业研究所提供，试验于新疆畜牧科学院草业研究所生物技术实验室进行。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

将2种碱性盐Na2CO3、NaHCO3均按摩尔比9∶1混合，人工模拟天然碱性生境条件以处理冰草幼苗。每个处理类型内设10、30、60、90、120 mmol/L 5个浓度，以0 mmol/L作为对照(CK)，碱胁迫组pH值在7.6～10.8。冰草幼苗在含有处理液的营养液中生长14 d后取样测定指标。

1.2.2 测定指标1.2.2.1 电导率

采用电导率仪法测定溶液电导率。

1.2.2.2 水势

采用小液流法。

计算植物水势：ΨW=Ψπ-CRTi(MPa)式中：ΨW为植物的水势(MPa)；Ψπ为溶液的渗透势(MPa)；R为气体常数，0.008 314 L.Pa/(mol·K)；T为绝对温度(273+t℃)K；i为解离系数。

1.2.2.3 相对生长率

相对生长率=(ln处理前整株干重-ln处理前后整株干重)/处理天数。

1.2.2.4 相对含水量

相对含水量=(鲜重-干重)/鲜重×100%。

1.2.2.5 根系生长溶液的pH值

用PHS-3C笔式酸度计以电位测定法来测量溶液pH值。

1.2.2.6 根系组织pH值

先用自来水冲洗干净，再用吸水纸吸干后，压榨其汁液，用精密试纸测定。

1.2.2.7 根系组织有机酸含量和种类

参照李德华等[22]的方法，随机选取3株处理过的冰草幼苗并用蒸馏水冲洗干净，将根系置于盛有适量蒸馏水(浸没根系即可)的三角瓶中24 h收集分泌物，每处理重复3次，采用液相色谱-质谱联用法(LC-MS)测定收集液中有机酸的种类和含量。

1.3 数据处理

采用Excel 2003对原始数据进行整理及图表绘制，采用SPSS 17.0进行单因素方差分析，以新复极差法进行多重比较，显著水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 碱胁迫对塔乌库姆冰草相对生长率的影响

研究表明，塔乌库姆冰草经不同浓度的碱液处理14 d后，随处理液浓度的增加，离子浓度逐渐增大，电导率不断升高，水势不断下降，相对含水量逐渐降低，胚根和胚芽生长均呈下降趋势，植株受胁迫不断加重。处理液浓度10 mmol/L时，胚根胚芽的生长率下降缓慢，与对照差异不明显。当处理液浓度超过10 mmol/L时，胚根的相对生长率随处理液浓度的增加呈直线下降趋势，各处理之间差异显著；胚芽的相对生长率随处理液浓度的递增缓慢下降；当处理液浓度为120 mmol/L时，胚芽的相对生长率比对照下降25.37%，胚根的相对生长率比对照下降60.50%，胚根相对生长率降幅更大，胚根受碱胁迫的抑制更明显。表1，图1

表1 处理液基本信息Table 1 Basic information table of processing liquid

2.2 碱胁迫对塔乌库姆冰草根系内外pH影响

研究表明，处理前各处理随处理液浓度的增加，根系外pH迅速升高，之后趋于稳定；相同碱液浓度下，处理后的根系外pH值较处理前有所下降，但都高于处理前pH。表2

其pH值随碱液浓度的递增保持在6.65～6.68，除浓度为90 mmol/L外，其它浓度条件下根系内pH值与对照差异不显著，保持了根系内pH不受外部环境的影响。冰草根系在高pH条件下仍旧能保持细胞内pH稳定，能够一定程度上降低根系溶液pH值。表2

表2 根系pH值变化方差Table 2 Variance analysis table of root pH variation

2.3 碱胁迫下冰草根系有机酸含量变化

研究表明，组织中有机酸以酒石酸为主，包含柠檬酸和少量苹果酸，含量依次为酒石酸>柠檬酸>苹果酸。随着碱胁迫浓度的升高，酒石酸的含量呈现明显下降的趋势，各浓度处理下酒石酸含量均与对照差异显著。对照中酒石酸含量呈最高值，为231.67×106μg/kg，150 mmol/L处理时酒石酸含量最低为22.97×106μg/kg，仅为对照的9.91%；10 mmol/L酒石酸含量与对照相比下降了27.91%(P<0.05)，30 mmol/L相比对照减少了53.38%；60、90、120 mmol/L处理相比，酒石酸含量无显著差异(P>0.05)，但是相比对照分别减少了79.85%、82.91%、78.23%，呈显著降低趋势(P<0.05)，随着碱液浓度的升高酒石酸的积累会受到明显抑制。图2

苹果酸的含量在碱胁迫下呈现出先升高后降低的趋势。与对照相比，10、30、60 mmol/L浓度下与对照差异显著(P<0.05)，在60 mmol/L浓度时苹果酸含量最高，为对照含量的3.55倍；当浓度≥90 mmol/L时，苹果酸含量出现明显下降，各浓度差异不显著(P>0.05)，在浓度为120 mmol/L时，苹果酸的含量最低，与对照相比降低65.03%。图3

柠檬酸的含量随处理液浓度的增加呈现先升高后降低的趋势，这与苹果酸的积累过程表现出协同一致性。在处理液浓度为60 mmol/L时柠檬酸的含量达到最大值，为对照的1.91倍，与其它浓度含量差异显著；浓度≥90 mmol/L时，柠檬酸的含量逐渐降低，当浓度为150 mmol/L时，柠檬酸的含量仍高于对照(P<0.05)，为对照的1.16倍。图4

3 讨 论

3.1 碱胁迫对塔乌库姆冰草生长的影响

当种子萌发时，胚根首先突破种皮，发育成幼苗的根，胚芽突破种皮后发育成叶和茎。胚根是植物吸收水分的主要器官，根尖部位是感知胁迫最敏感部位，植株受到的胁迫往往最先由根部感知[24]。试验中，随处理液浓度的增加，胚根胚芽的相对生长率都呈下降趋势，即相对生长率与pH值呈负相关关系，结果与前人研究结果[25-27]相一致，其原因可能是根部直接接触碱液环境，是最直接遭受胁迫的器官，植物会通过根系生理上的一系列改变来适应碱胁迫伤害，如通过改变对养分的需求维持自身代谢和改变根系形态、生理机能来增强自身活化和吸收养分的强度[28-30]等，致使其生长受抑制作用更明显。

3.2 根系溶液及根系组织pH值的变化

稳定的内环境pH是所有生物维系正常新陈代谢的必要条件，植物在受到外界逆境胁迫时，为保持体内酶活性，就必须尽可能调节细胞内环境pH不受环境干扰[23]。

实验幼苗根系在含有处理液的营养液中生长，根系一方面从中摄取养分和水分，另一方面向其分泌质子、释放无机离子、或大量的有机物质，这些物质统称为根系分泌物[31]。根系分泌物组成和含量的变化是作物响应环境胁迫最直接、最明显的反应[32]。试验发现，处理前溶液pH值在9.2～10.1，处理后根系溶液的pH值都较处理前有所下降，总体保持在8.5～9.2；根系组织的pH值保持在6.61～6.68，仅处理液浓度为90 mmol/L时与对照差异显著；植物在受到碱胁迫时，通过根系分泌某种物质中和、稀释或者缓冲高pH对根系的伤害，以保证植物正常生长。

3.3 碱胁迫对塔乌库姆冰草有机酸含量的影响

有机酸是一类有缓冲作用的羧酸化合物，是许多化合物合成的前体，也是植物体内物质和能量代谢的重要中间产物[33]。某些非生物逆境因子可明显增加植物根系分泌有机酸[34]，有机酸的合成、累积、转运和分泌的增加是植物应对环境胁迫的一种响应[35]，通过分泌有机酸调节根际微环境pH以缓解营养胁迫，这是对环境的一种适应性反应[36]。

研究在实验过程中共检测到酒石酸、苹果酸、柠檬酸3种有机酸。在未受到碱胁迫时，酒石酸的含量浓度为231.67×106μg/kg，苹果酸和柠檬酸的含量分别为1.63×106、4.37×106μg/kg，酒石酸浓度远远大于苹果酸和柠檬酸，其是植物幼苗在未受到逆境胁迫时植株内主要参与调控代谢的有机酸。酒石酸的含量随碱液浓度的增加呈急剧下降趋势，高浓度的碱液环境抑制了酒石酸的积累，当碱液浓度≥60 mmol/L时其含量仍呈减少趋势，但差异不显著。

苹果酸是三羧酸循环及其支路乙醛酸循环代谢过程中的重要中间产物[37]，能通过呼吸作用对植物体内许多代谢过程产生调控[38]。当植物受到重金属、干旱、盐碱、高温等非生物胁迫时，细胞中的苹果酸积累量会显著增加，在提高植物抗逆能力方面发挥重要作用[39-41]。柠檬酸也是三羧酸循环的重要代谢产物，广泛分布于植物、动物与微生物细胞中，可以促进机体腺苷三磷酸(ATP)的生成，促进新陈代谢、恢复细胞活力[42]。苹果酸与柠檬酸的含量较酒石酸含量低，但是在碱胁迫条件下，二者调节冰草根系内pH的作用是明显的。杨春武等[42]结果表明，有机酸积累是小冰麦(Triticumaestivum-Agropyronintermedium)在碱胁迫下保持体内离子平衡和pH稳定的关键生理响应。苹果酸与许多植物的抗逆作用密切相关[44]，研究中发现苹果酸在未受到碱液胁迫时，在植株体内含量仅为1.63×106(μg/kg)，随着pH的增加，其含量在60 mmol/L时显著积累达到最大值即5.78×106(μg/kg)，与其它各处理差异显著，超过60 mmol/L苹果酸含量大幅降低甚至低于对照，苹果酸各处理含量无差异，失去pH调节作用；柠檬酸与苹果酸总体趋势一致，也在60 mmol/L时达到最大值8.35×106(μg/kg)，比对照增加了2倍的积累量。干旱胁迫下棉花体内柠檬酸积累的现象[45]，盐胁迫下苜蓿根中柠檬酸含量增加的现象[46]。杨国会[9]在碱胁迫诱导小冰麦有机酸积累和分泌的研究中发现，碱胁迫下苹果酸、柠檬酸含量随碱胁迫而显著增大，与研究结果相一致。当碱液浓度大于60 mmol/L时柠檬酸含量缓慢降低，总体仍高于对照，高浓度的pH继续诱导植物根系分泌以柠檬酸为主的有机酸，以中和高盐对植物体的伤害是塔乌库姆冰草针对碱胁迫的特异生理响应。

3.4 有机酸变化趋势与pH值之间的关系

在不同浓度的碱液胁迫下根系分泌的有机酸中发现，酒石酸的含量在碱液浓度为60 mmol/L即pH为9.8时与低浓度碱液胁迫时差异显著，大于60 mmol/L时与碱液浓度150 mmol/L差异显著，其它浓度差异不显著，由此得出60 mmol/L为酒石酸分泌量的重要拐点，超过60 mmol/L酒石酸分泌量趋于稳定，对pH的控制作用不明显；苹果酸和柠檬酸的含量均在碱液浓度为60 mmol/L时达到分泌量的最大值，与其它各浓度差异显著，60 mmol/L是苹果酸和柠檬酸分泌量的高峰点。张一弓[20]在对碱胁迫下塔乌库姆冰草的萌发及生理响应研究中发现碱胁迫浓度≤60 mmol/L，即pH≤9.8是塔乌库姆冰草能够萌发和生长的最大耐碱性范围，该结论与该文的研究结果相呼应。塔乌库姆冰草在碱液浓度为60 mmol/L、pH为9.8时如此耐碱，是通过积累以苹果酸和柠檬酸为主的有机酸来维持根系组织pH稳定，通过分泌有机酸调节根系环境pH，以中和或缓冲碱胁迫。

4 结 论

碱胁迫致塔乌库姆冰草胚根胚芽生长缓慢，胚根受抑制更明显；随处理液浓度的增加，幼苗根系会分泌以苹果酸、柠檬酸为主的有机酸，二者相互作用抵御高pH对植物的伤害，使植物根系内pH保持在6.65～6.68。冰草根系分泌的有机酸在碱胁迫过程中虽然明显增加，但不能阻止高浓度的pH对植物幼苗的伤害，处理液浓度为60 mmol/L，即pH为9.8时，有机酸分泌量为调控冰草根系pH最适宜浓度。