基于网络药理学方法赤芍-牡丹皮药对治疗中风作用机制探讨

马怀芬，龙凯花，朱凤霞，孟婷婷，王春柳

(1.西安培华学院，陕西 西安 710125；2.陕西省中医药研究院，陕西 西安710003)

中风是一种存在于临床中的、普遍的神经疾病，主要表现为突然昏厥、患者大部分都会出现身体正常功能严重受损的后遗症，即平常所说的半身不遂、言语不清。发病后患者生理变化非常明显，容易造成残疾。它主要包括缺血性中风以及出血性中风两种。常是因为血管堵塞造成的大脑血管破裂，从而造成脑组织损伤[1-2]。由于该病复发率、病死率、致残率高，对中老年的健康及生活质量带来严重威胁，患者存活后，遗留不同程度致残，常见失语、偏瘫和认知障碍等临床表现[3-4]。西医临床常采用组织纤溶酶原激活物治疗，但不良反应较多，如治疗时间窗短、增加病死率及神经毒性等，还采用抗凝药物治疗，但疗效不理想。所以，找到更加高效的治疗方案以及药物成为了医学研究目标。

中风主要是由于内虚邪中，阴阳失调，上脑而失清，其受到虚、火、风、痰、气、血等多种因素的影响。在提高存活率、预后生存质量，降低病死率、致残率等方面，中医治疗中风具有丰富的临证经验。赤芍、牡丹皮均为毛茛科植物,两者化学成分类似，均为清热凉血药，临床常相须为用，协同增效。赤芍性苦，破瘀血，散血块[5-6]；牡丹皮味酸，破血、行血[7-8]，为中医临床活血化瘀、治疗中风病常用药对，用于血瘀轻症。但药对赤芍-牡丹皮用于治疗中风的关键作用靶点，作用机理及信号通路等方面目前仍未阐明清楚。为阐明药对的作用机制，运用网络药理学分析其可能的作用机制。网络药理学主要从分子与基因水平两方面分析药物的作用靶点，以此探究药对赤芍-牡丹皮治疗中风的作用机制[9]，揭示赤芍-牡丹皮药对治疗中风的多靶点、多通路协同作用机制。

1 材料与方法

1.1 采用及参考的数据库 见表1。采用及参考的数据库包含有TCMSP、DAVID、STRING等。

表1 采用及参考的数据库信息

1.2 筛选药材化学成分-疾病靶点 充分发挥中药系统药理学分析平台的作用(TCMSP)，本文选择了赤芍与牡丹皮来当作主要分析对象，探究了赤芍与牡丹皮主要包括哪些化学成分。

1.3 筛选活性有效化合物 筛选条件：查阅相关中药的活性成分，如：赤芍与牡丹皮，并对相关的目标活性成分群进行确定。化合物类药性(DL)必须≥0.18，口服生物利用度(OB)必须≥30%。

1.4 中风和活性成分的靶点获取 本文主要是从TCMSP数据库、Drug Bank数据库以及Genecards 数据库找到了分析中风相关的靶点所需要的资料。

1.5 网络构建与分析 采用线维恩软件对相关的成分与疾病靶点的交集靶点进行了绘制，再由STRING数据库搜集到的相关资料，成功绘制出了蛋白互作网络图。根据交集靶点，归属相对应的活性成分；运用Cytoscape 3.7.0分别绘制PPI网络图和疾病-药材-活性成分-靶点网络图。

1.6 基因功能富集分析与生物过程分析 借助DAVID数据库探讨了中药赤芍以及牡丹皮的核心作用靶点，对现阶段关注度比较高的GO功能与KEGG 通路富集做了相关研究。

2 结 果

2.1 筛选药材化学成分-疾病靶点 从TCMSP数据库中，收集赤芍、牡丹皮中ADME性质符合要求化合物共计40种化学成分，其中来自赤芍的有29种，来自丹皮的有11种，上述化学成分相关靶点共174个。

去重复后，通过四个数据库(TCMSP、Drug Bank、TTD、Genecards)得到总计167个作用靶点都与中风相关，再在UniProt数据库将这些靶点信息传输进来即可转化为Official Gene Symbol(图1)。

图1 赤芍-牡丹皮药对活性成分-靶点与疾病靶点PPI网络

基于PPI图归属的活性成分共有17种，见表2。其中豆甾醇和儿茶素是赤芍和牡丹皮共有成分。

表2 赤芍-牡丹皮的化合物信息

网络拓补分析显示，网络拓补学参数BC、CC、Degree同时满足大于均值成分作为活性成分，分别为槲皮素、山奈酚、黄芩苷、鞣花酸4个成分(图2)。

图2 赤芍-牡丹皮药对疾病-药材-活性成分-靶点网络

在这个环节，需要把交集靶点还有其所属通路映射关系传输到Cytoscape 3.7.0中去，此时就可以得出潜在靶点-通路网络(图3)。对图3进行网络拓补分析可知，网络拓补学参数BC、CC、Degree同时满足大于均值靶点作为核心靶点，22个核心靶点分别为：AKT1、MAPK1、MAPK8、JUN、TNF、IL6、FOS、TP53、TGFB1、CCND1、IL1B、EGFR、CASP3、BCL2、GSK3B、BAX、VEGFA、CXCL8、CASP8、STAT1、MYC、MMP9。

图3 赤芍-牡丹皮药对治疗中风潜在靶点-通路网络

2.2 KEGG与GO分析 在阈值为P< 0.05的条件下，通过 DAVID 数据库对有效活性成分的作用靶点进行KEGG 通路富集分析与GO功能注释，得到了排名在前几位的生物过程与通路绘图(图4、5)。

图4 赤芍-牡丹皮药对治疗中风潜在靶点GO功能注释

图5 赤芍-牡丹皮药对治疗中风潜在靶点KEGG分析

以上图中可以看出，BP主要集中在活性氧代谢过程、有毒物质及脂多糖等相关反应中，并且还可以观察到：MF集中蛋白异源二聚体活性、核受体活性、细胞因子受体进行结合，CC功能集中膜微区与囊腔功能，初步推断药对赤芍-牡丹皮主要通过以上途径治疗中风。在对赤芍-牡丹皮药对治疗中风潜在靶点KEGG通路分析后，按照每条通路上富集靶点数量排名前10位的通路有VERF通路、Toll样受体通路、TNF通路、IL-17信号通路、P13K-Akt通路等。

3 讨 论

中风的病理过程比较难以理解，其主要表现为突然昏厥、患者大部分都会出现身体正常功能严重受损的后遗症，即平常所说的半身不遂、言语不清。赤芍、牡丹皮均为毛茛科植物,两者化学成分类似，均为清热凉血药，临床常相须为用，协同增效,为活血化瘀常用药对[10-11]。而本文所研究的赤芍，其化学成分包括赤芍苷、有机酸、黄酮类、糖类及挥发油等，具备了多种药理效果，比如说抗凝、有效减小血液黏稠度、使得人体微循环更加顺利；并且还能够舒通血管[12]，牡丹皮的化学成分包括了酚及苷类成分、单萜及其苷类成分、三萜类成分、香豆素类成分等多种，具备了多种药理效果，比如说疏通血管、可以有效降糖、促进机体免疫系统功能的发挥，并且还可以抑菌抗炎[13]。

赤芍-牡丹皮药对能够促进中风患者的恢复[14]，在网络药理学方法基础上，对赤芍-牡丹皮药预防中风的效果以及原理作了相关研究。在目前得到的重点靶点中，靶点TNF、IL-6、IL-10是常见的炎症氧化应激等通路靶点，在中风的病理过程中多有报道[15-17]；KEGG分析得到的通路如TNF 是凋亡相关的经典信号通路。药对中含有β-谷甾醇，可通过抑制 TNF 相关信号通路，产生免疫调节反应，可以作用于炎症的多个环节[18]。IL-17 属于人体的其中一种细胞因子，其生物学活性比较有代表性，能参与人体大多数的炎性反应过程[19]，研究结果表明，中风患者发生病变的周围组织中 IL-17 表达过高且活性强度增加，因此炎性反应加重，并诱发细胞出现损伤，使得病情加剧恶化[20]。与氧化作用有关的HIF1 通路中释放的转录因子HIF-1α，是一种在缺氧的微环境下能使机体细胞发挥关键作用的因子。使机体细胞在缺氧的环境下能提高活性，主要通过调控相关基因转录与表达的方式，使机体细胞在缺氧的环境中适应低氧状态。研究结果指出，中风患者避免不了脑水肿区域的产生，该区域会让其附近组织呈现低氧，导致血清中 HIF-1α 的水平大幅度上升。

初步分析发现在赤芍-牡丹皮药对化学成分与中风最为密切相关的为槲皮素、山奈酚、黄芩苷、鞣花酸4个化学成分。其中鞣花酸和黄芩苷是赤芍的活性成分，槲皮素、山奈酚为牡丹皮的活性成分，鞣花酸虽然没有在赤芍/牡丹皮中作为主要活性成分，但从分析结果看，鞣花酸也可能是治疗中风的潜在强活性成分。当前赤芍的质量控制成分为芍药苷，牡丹皮的质控成分为丹皮酚，只是可能基于研究热度等原因未能排列在最前面，但在本文的分析中上述两种成分也属于核心药效成分。在此基础上，研究结果能够指导赤芍-牡丹皮物质基础研究。

在网络药理学方法基础上，详细探讨了赤芍-牡丹皮药对治疗中风患者的原理以及可以起到的效果，发现赤芍-牡丹皮药对可能是通过VERF通路、Toll样受体通路、TNF通路、IL-17信号通路、P13K-Akt等通路协同作用发挥治疗/缓解中风功效，上述预测结果可为赤芍-牡丹皮药对在中风治疗的药理作用研究及临床应用提供一定的理论依据，但还需要先一步的实验研究。