胶质瘤中Circular RNA PRKCI的表达及预后相关影响因素研究

陈 隆，张玉富

(空军军医大学唐都医院神经外科，陕西 西安 710038)

胶质瘤是世界范围内常见的颅内恶性肿瘤，每年40多万人因患胶质瘤而死亡[1]。世界卫生组织(WHO)将胶质瘤分为低级别(WHO I级和Ⅱ级)和高级别(WHO Ⅲ级和IV级)。虽然胶质瘤患者可以通过手术切除联合术后放化疗治疗，但患者存活率相当低。有研究[1-2]表明胶质瘤患者的5年生存率不到15%，中位生存期只有12～18个月。近年来，研究人员开始关注胶质瘤的分子机制、预后及生物标志物治疗，试图开发针对胶质瘤患者的分子靶向治疗，以控制胶质瘤的进程[3-4]。环状RNA(Circular RNA)是一种特殊类型的非编码RNA，由内源性RNA共价结合形成闭合环，其没有5’端帽子和3’端PolyA尾巴，主要分布在细胞质中。环状RNA于20世纪70年代于病毒中首次被发现，最初被认为是一种错误的剪切产物[5]。但近年来，高通量测序和生物医学研究证实了许多环状RNA为组织特异性表达，且在各种生理病理过程中起重要的调节作用。更有越来越多的研究表明，环状RNA在胶质瘤中差异表达，调节胶质瘤的发生、增殖和侵袭，因此可能成为胶质瘤诊断的潜在标记物[2]。此外，一些环状RNA与胶质瘤分期有关，可能有助于判断患者的预后[6]。有文献[7]报道，Circular RNA PRKCI通过竞争性抑制microRNA-545的作用，从而促进胶质瘤的增殖和侵袭。鉴于此，本研究旨在探讨Circular RNA PRKCI在脑胶质瘤中的表达及其预后意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 经病理确诊的61份胶质瘤标本取自从2012年5月至2015年1月开始在空军军医大学唐都医院神经外科接受手术的患者，年龄25～78岁，其中男性37例，女性24例，WHO Ⅰ级12例，WHO Ⅱ级15例，WHO Ⅲ级16例，WHO Ⅳ级18例。另有35例正常脑组织标本取自本科颅脑损伤患者，其中男性21例、女性14例，年龄21～63岁，术前影像学及病史询问均无胶质瘤病史，患者均行开颅手术清除受伤病灶，其组织作为本研究的对照组。术前患者均未接受放化疗，也排除患者有其他重大疾病及未同意参与实验者。所得标本保存于液氮中。本研究获得了唐都医院伦理委员会书面同意及批准，实验过程严格按照指导方针执行。

1.2 研究方法 对照组组织和胶质瘤标本用Fast Start Universal SYBR Green Master(德国罗氏)对总RNA进行cDNA和RT-qPCR检测，选择GAPDH作为内源性对照。聚合酶链式反应RNA样品用TRIzol试剂提取。分光光度计检测A260/280和A260/230处的光密度值，评价提取RNA的浓度和纯度。将RNA反转录为cDNA，再用qRT-PCR进行扩增，检测相关基因的表达。实验所用到的相关引物：Circular RNA PRKCI正向：5’-ATTCAGGGACACCCGTTC-TT-3’和反向：5’-CTCTTCAGAACACTTGCAGCT-T-3’，GAPDH正向：5’-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3’，反向：5’-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3’)。

2 结 果

2.1 Circular RNA PRKCI在胶质瘤组和对照组中的表达 见表1。结果显示，与对照组相比，Circular RNA PRKCI在Ⅰ-Ⅱ级的胶质瘤组织中显著降低[(1.000±0.2287)与(2.707±0.1979),P<0.001]，且Ⅲ-Ⅳ级胶质瘤组织中的表达较Ⅰ-Ⅱ级低[(2.707±0.1979)与(3.830±0.2169),P=0.0019]。

表1 Circular RNA PRKCI在对照组和胶质瘤组织中的表达

2.2 Circular RNA PRKCI水平与胶质瘤患者临床病理特征的关系 见表2。根据Circular RNA PRKCI表达均值，将61例胶质瘤患者分为低表达组(28例)和高表达组(33例)。Circular RNA PRKCI的表达水平与WHO分级、KPS评分显著相关，此外，Circular RNA PRKCI的表达与年龄、性别、肿瘤大小、癌症家族史无明显相关性。

表2 Circular RNA PRKCI表达与胶质瘤患者临床病理指标的关系(例)

2.3 Circular RNA PRKCI表达水平与患者预后的关系 Kaplan-Meier分析和对数秩检验显示，Circular RNA PRKCI高表达患者的5年存活率比低表达Circular RNA PRKCI的患者差，差异有统计学意义(P=0.0309),见图1。进一步评估Circular RNA PRKCI的预后作用，COX分析Circular RNA PRKCI和其他临床参数对患者预后的影响，结果表明，WHO分级、KPS评分、Circular RNA PRKCI表达水平与患者预后有关，且Circular RNA PRKCI过度表达(P<0.001)可作为胶质瘤患者的预后的独立预测因子,见表3。

图1 Circular RNA PRKCI高表达和低表达患者生存时间比较

表3 胶质瘤患者各项临床病理指标的单因素和多因素分析

3 讨 论

胶质瘤是一种严重威胁人类生命的恶性肿瘤，主要影响脑内的胶质细胞，而胶质细胞在神经元的相互作用中发挥了重要的调节作用，加上胶质瘤的侵袭性生长，很难通过外科手术完全切除肿瘤[8-10]。因此，尽管在神经肿瘤的诊疗方面取得了长足的进步，但胶质瘤患者的存活率仍然很低，据报道低WHO分级胶质瘤患者的平均生存时间约为60个月，而高WHO分级胶质瘤患者的平均生存时间仅有13个月[11-13]。

环状RNA早在20世纪70年代在病毒中被发现，后又于多种生物体内检测到环状RNA的存在，但其一直被认为是错误的剪接产物，在体内无实际功能[14-15]。而新近研究表明，环状RNA可参与调节转录、转录后、表观遗传等基因表达网络[16]。CircRNA在多种疾病尤其是肿瘤中均有不同程度的表达，可作为新的诊断和预后的生物标志物，且与其他RNA相比，环状RNA干预具有较少的脱靶和副作用。因此，环状RNA是更有前景的分子治疗靶点[17]。我们所研究的Circular RNA PRKCI分子此前已被证实在多种肿瘤中具有促癌作用，其在食管癌中的表达水平高于正常对照，且通过miR-3680-3p作为内源竞争RNA调节AKT3的表达，这可能在食管癌的发病机制中发挥重要作用[18]。环状Circular RNA PRKCI通过与在胃癌组织和细胞系中错误地高表达，并通过结合microRNA-545，促进胃癌细胞增殖和侵袭[19]。此外，Circular RNA PRKCI还通过与microRNA-1324结合促进MECP2的表达从而促进肺癌进展，提示我们Circular RNA PRKCI可能成为治疗肺癌的潜在靶点[20]。

我们的研究证实了Circular RNA PRKCI在胶质瘤中高表达，与此同时，数据分析表明高WHO分级的胶质瘤患者具有更高水平的Circular RNA PRKCI，提示Circular RNA PRKCI可与胶质瘤的恶性程度有一定关系。随后我们分析了Circular RNA PRKCI水平与临床病理特征的各项指标，得到Circular RNA PRKCI的表达与WHO分级、KPS评分、显著相关，与年龄、性别、肿瘤大小、癌症家族史无明显关系的结果。我们进一步探讨了患者预后与Circular RNA PRKCI有无联系，根据统计结果，我们发现Circular RNA PRKCI的高表达与患者5年生存率低下有关，单因素和多因素分析显示高表达的Circular RNA PRKCI的表达水平与高WHO分级、低KPS评分是影响预后的独立危险因素。这些结果可能为Circular RNA PRKCI导向诊断和治疗脑胶质瘤的研究提供新的视角和方向。

综上，Circular RNA PRKCI在胶质瘤组织中高表达，且其过表达可能导致了患者的不良预后。对Circular RNA PRKCI的进一步研究对今后胶质瘤等疾病的诊断和治疗具有重要的临床意义。