血清细胞角蛋白18、骨桥蛋白水平与原发性喉癌患者临床分期相关性研究

屈 慧，皇 海，张 蕊

(空军军医大学西京医院，陕西 西安710032)

肿瘤的临床分期一般根据国际抗癌联盟制定的肿瘤(TNM)分期确定，对肿瘤严重程度的判断和治疗方案的选择均具有一定的指导作用[1]。但是，TNM分期存在一定的局限，TNM分期需经穿刺活检或手术获得病理组织才能够评估肿瘤分期，但穿刺活检具有一定创伤性，患者多不易接受，而手术病理结果具有检查时间长的特点，易导致患者错过最佳治疗时间[2]。因此，早期检测与肿瘤临床分期相关的指标，对于指导患者治疗和预后预测具有重要的意义。细胞角蛋白 (Cytokeratin，CK)是一种蛋白质，包括CK18、CK19等，在人体上皮细胞中广泛存在，具有分化特异性，与上皮来源的恶性肿瘤具有一定的联系，可能与原发性喉癌的临床分期有关[3]。已有研究证实，CK与喉癌的转移、复发等具有密切的联系[4]。骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)是一种磷酸化糖蛋白，能连接骨细胞外基质及骨细胞，与细胞恶性转化相关[5]。研究表明，OPN与恶性肿瘤的发生发展具有紧密的联系，可能促进肿瘤浸润、转移，加重肿瘤恶性程度[6]。由此推测，CK、OPN可能均与原发性喉癌临床分期相关，但是，目前尚无研究对此进行分析。本研究分析血清CK18、OPN水平与原发性喉癌患者临床分期的相关性，为分析喉癌发生发展的分子生物学基础提供方向。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究经空军军医大学西京医院医学伦理委员会审核通过，选择93例原发性喉癌患者作为研究对象，患者与家属均知情且自愿签署同意书。其中，男79例，女14例；年龄44～82岁，中位年龄53.00(47.00，58.00)岁；体重指数18.98～24.46 kg/m2，中位体重指数22.46(22.10，22.83)kg/m2。病例纳入标准：①符合《头颈部恶性肿瘤诊断治疗指南》[7]中原发性喉癌诊断标准；②经纤维喉镜和病理活检确诊为原发性喉癌；③存在声嘶、咽痛、呼吸困难、咽部异物感等临床症状；④初诊患者。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②合并其他严重躯体疾病；③合并自身免疫性疾病；④合并糖尿病、肾损伤等其他影响CK18、OPN的疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞角蛋白检测：采集患者入院时3 ml空腹静脉血，离心机(凯达，KS50R)3000 r/min (半径12 cm)离心15 min，用武汉默沙克生物科技提供的试剂盒，以酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清CK18、CK19水平。

1.2.2 OPN检测：采集患者入院时2 ml空腹静脉血，离心机(凯达，KS50R)3000 r/min(半径12 cm)离心15 min，用武汉艾美捷科技提供的试剂盒，以ELISA测定血清OPN水平。

1.2.3 肿瘤标志物检测：采集患者入院时6 ml空腹静脉血，离心机(湘锐，TDZ5-BP)3000 r/min(半径13.5 cm)离心操作10 min，取血清，以酶联免疫双抗体夹心法检测血清糖类抗原50(CA50)、糖类抗原199(CA199)、癌胚抗原(CEA)、糖脂类抗原72-4(CA72-4)水平。

1.2.4 临床分期评估：进行纤维喉镜和病理活检，根据检查结果，参照TNM分期[8]分为晚期(TNM分期Ⅲ、Ⅳ期)和早中期(TNM分期Ⅰ、Ⅱ期)。

1.3 统计学方法 采用SPSS 24.0统计学软件进行数据处理，计量资料均经Shapiro-Wilk正态性检验，偏态分布计量资料用中位数(四分位数)[M(P25，P75)]表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验，计数资料用百分比表示，采用χ2检验，血清CK18、OPN水平与原发性喉癌患者临床分期关系采用Logistic回归分析检验；绘制受试者工作曲线(ROC)，并计算曲线下面积(AUC)值，检验血清CK18、OPN水平评估原发性喉癌患者临床分期的价值，AUC值>0.9表示评估性能较高，0.71～0.90表示有一定评估性能，0.5～0.7表示评估性能较低，<0.5表示无评估性能，CK18、OPN相关性采用Spearman相关性分析检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组患者临床病理特征和血清指标比较 本研究中93例原发性喉癌患者中，早中期62例，占66.67%(62/93)，其中Ⅰ期16例，Ⅱ期46例；晚期31例，占33.33%(31/93)，其中Ⅲ期27例，Ⅳ期4例。两组性别、年龄、体重指数比较，差异无统计学意义(P>0.05)；晚期组CK18、CK19、OPN、CA50、CA199、CEA、CA72-4高于早中期组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组患者临床病理特征和血清指标比较

2.2 血清指标与原发性喉癌患者临床分期关系Logistic回归分析 将2.1中比较结果显示差异有统计学意义的变量纳入作为自变量(均为连续变量)，将原发性喉癌患者临床分期作为因变量(1=晚期，0=早中期)，经Logistic回归分析检验结果显示，入院时血清CK18、CK19、OPN、CA50、CA199、CEA、CA72-4水平与原发性喉癌患者临床分期有关，CK18、CK19、OPN、CA50、CA199、CEA、CA72-4高表达可能是原发性喉癌患者进展至晚期的风险因子(OR>1，P<0.05)。见表2。

表2 血清指标与原发性喉癌患者临床分期关系Logistic回归分析

2.3 血清CK18、OPN水平评估原发性喉癌患者临床分期的价值 将原发性喉癌患者临床分期作为状态变量(1=晚期，0=早中期)，将入院时血清CK18、OPN水平作为检验变量，绘制ROC曲线图(图1)，结果显示，入院时血清CK18、OPN单独及联合评估原发性喉癌患者预后不良的AUC分别为0.886、0.832、0.899，均有一定评估价值，且当两者的Cut-off值分别取5.293 ng/ml、46.991 μg/L时，可获得最佳评估价值。见表3。

表3 血清CK18、OPN水平评估原发性喉癌患者临床分期的价值

图1 血清CK18、OPN水平评估原发性喉癌患者临床分期ROC曲线

2.4 原发性喉癌患者血清CK18、OPN相关性 经Spearman相关性分析检验，原发性喉癌患者血清CK18、OPN呈正相关(r=0.353，P<0.001)，见图2。

图2 原发性喉癌患者血清CK18、OPN相关性散点图

3 讨 论

原发性喉癌预后情况不佳，尤其是晚期喉癌，生存率较低，这与肿瘤的侵袭、转移有关[9-10]。因此，分析与原发性喉癌临床分期相关的血清指标，对早期发现侵袭和转移，指导治疗方案的选择和预后结果的预测，从而改善预后具有重要的意义。

CK主要分布于上皮细胞，在上皮起源的肿瘤中也有表达，与上皮起源的肿瘤具有密切的联系[11]。其中，CK18是上皮细胞骨架的组成成分，与上皮细胞的凋亡、裂解具有密切的关联，CK18水平的变化在一定程度上可反映上皮细胞恶变程度[12]。由此推测，CK的升高意味着癌症恶性程度的增加，可能与原发性喉癌临床分期相关。OPN属于分泌型磷酸化糖蛋白，广泛存在于人体内，在肿瘤的生长、转移、免疫反应等过程均有参与[13]，被证实在胃癌、肺癌等多种恶性肿瘤中呈高表达，与恶性肿瘤的发生发展具有联系[14-15]。OPN具有丰富的功能，可以分泌基质细胞、趋化因子等，参与细胞功能的调节，能通过结合整合素，调控信号转导，促进肿瘤的发生发展[16]。可见，OPN的水平变化可能也与原发性喉癌分期具有一定的联系。CA50、CA199、CEA、CA72-4均为常见肿瘤标志物，对肿瘤的鉴别诊断、转移预测、预后评估等均具有一定的价值，可在一定程度上反映原发性喉癌的临床分期。本研究对比不同分期原发性喉癌患者血清指标发现，晚期组CK18、CK19、OPN、CA50、CA199、CEA、CA72-4高于中早期组。说明CK、OPN、肿瘤标志物均可能与原发性喉癌患者临床分期具有一定的关联。进一步经Logistic回归分析发现，入院时血清CK18、CK19、OPN、CA50、CA199、CEA、CA72-4水平与原发性喉癌患者临床分期有关，CK18、CK19、OPN、CA50、CA199、CEA、CA72-4高表达可能是原发性喉癌患者进展至晚期的风险因子。相较于CK19，CK18对原发性喉癌进展至晚期的影响因子更大。因此，本研究重点分析CK18与原发性喉癌临床分期的关系。分析原因为：晚期原发性喉癌患者上皮细胞转变为癌细胞的进程较快，促进CK18被含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶分解后释放入血，从而增加血清中CK18含量[17]。因此，晚期原发性喉癌患者血清CK18水平较高。CK18在癌症细胞中高度表达，不仅利于癌细胞正常结构形态的维持，保护癌症细胞，同时还会对癌细胞信号传导途径进行调节，促进癌细胞的增殖[18]。此外，CK18能诱导转移生长因子β1，刺激锌指转录因子、上皮性肿瘤细胞增加，促进上皮间质转化，进而促进肿瘤侵袭和转移，导致原发性喉癌患者进展为晚期[19-20]。OPN与原发性喉癌临床分期有关，可能是由于：癌症的进展与癌细胞的侵袭和转移有关，涉及细胞外基质分解、细胞黏附等[21-22]。OPN能结合整合素受体，激活基质金属蛋白酶，促进基质金属蛋白酶分解细胞外基质，从而促进癌细胞的侵袭、黏附和转移，而且OPN转录活性增强后，刺激诱导癌细胞的转移[23]。OPN参与细胞的分裂和浸润，能对骨钙的沉积进行调节，且可通过结合骨组织中的羟磷灰石，影响癌细胞的迁移[24]。OPN能通过促进细胞免疫应答，诱导肥大细胞，从而促进肿瘤组织新生血管的形成，抑制癌细胞的凋亡，加重原发性喉癌[25]。此外，CA50、CA199、CEA、CA72-4为常规肿瘤标志物，目前与原发性喉癌进展相关研究较多，本研究并未进一步对其进行详细分析。本研究结果为分析血清CK18、OPN对原发性喉癌患者病情程度的评估价值，绘制ROC曲线图，结果显示，入院时血清CK18、OPN单独及联合评估原发性喉癌患者预后不良的AUC分别为0.886、0.832、0.899，均有一定评估价值。说明，血清CK18、OPN可用于原发性喉癌患者临床分期的评估。另外，本研究经Spearman相关性分析检验，原发性喉癌患者血清CK18、OPN呈正相关。但目前机制尚不清楚，后续应增加相关研究加以证实。

综上所述，血清CK18、OPN水平与原发性喉癌患者临床分期相关，可用于原发性喉癌患者临床分期的评估。