核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体对糖尿病性视网膜病变新生血管形成和血管拟态标志物的影响

杨晓岗，储昭节，张 婷

(西安市第一医院眼科，陕西 西安 710002)

流行病学资料显示，糖尿病及其血管并发症的发病率呈现出了逐年升高的趋势，该疾病的发生严重威胁着人们的身体健康和心理健康。糖尿病性视网膜病变(Diabetic retinopathy，DR)是糖尿病常见的慢性微血管并发症[1]。对于眼部正常的糖尿病患者来讲，每年约有5%～10%的人就会出现视网膜病变。DR发病机制复杂，尚未完全阐明[2]，但是该病症的发生会影响视网膜新生血管的形成。近年来的研究[3-4]表明，炎症反应可能参与了DR血管生成的分子机制。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)作为免疫系统的重要组成部分，在糖尿病以及肿瘤等多种疾病的发生发展过程中发挥出了关键性作用。同时，NLRP3还与多种眼部疾病之间存在密切的相关性[5]。本研究选取了65例因增殖性玻璃体视网膜病变且行经睫状体扁平部23G标准三通道玻璃体切割术的患者作为研究对象，从而探究NLRP3炎症小体对DR晚期新生血管形成和血管拟态标志物的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2019年5月至2021年5月于我院眼科确诊的增殖性玻璃体视网膜病变患者，且行经睫状体扁平部23G标准三通道玻璃体切割术者65例。病例纳入标准：诊断为糖尿病性视网膜病变患者，术眼的对侧眼符合增殖性糖尿病性视网膜病变的诊断标准；非糖尿病性视网膜病变引起的增殖性玻璃体视网膜病变患者，对侧眼没有糖尿病性视网膜病变的相关眼底改变；患者临床资料完整准确，所有研究对象均已签署知情同意书。排除标准：存在眼外伤以及其他眼部并发疾病，如青光眼等；合并有严重的心脏、肝脏以及肾脏等器官功能衰竭的患者；患者不能配合完成本次试验的。

1.2 研究方法

1.2.1 实验分组：纳入研究的65例患者经内科检查，其中38例患者确诊为2型糖尿病视网膜病变，为本研究的试验组；27例患者为非糖尿病视网膜病变，为本研究的对照组。

1.2.2 标本采集：所有患者均进行玻璃体切割手术[6]。在手术过程中用视网膜剪以及视网膜镊获得患者的纤维血管膜组织，根据实验需要，采用随机数字表法随机分配所得标本，部分患者的标本立即用浓度为4%的多聚甲醛溶液固定，常规酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，以3 μl的厚度完成连续的切片，备用；其他患者的标本则移入已消毒的离心管中，置于低温冰箱中，立即送往实验室，放入-80 ℃超低温冰箱中冻存并备用。

1.2.3 新生血管密度检测：标本进行免疫组织化学染色，均置于100倍的光学显微镜下找到新生血管密集的区域，然后调节放大倍数至400倍，于光学显微镜下选择不同的视野进行观察，分别统计每个视野内结构完整且没有分散破裂的新生血管个数，其中，出现管腔的不计。选取新生血管数量最多的3个视野，计算其平均值作为新生血管的最终密度数，同时进行分级统计。分级标准如下[7]：新生血管数目为0～3个的记为+；新生血管数目为4～10个的记为；新生血管数目高于10个的记为。

1.2.4 NLRP3炎症小体表达水平检测：标本严格按照全蛋白提取试剂盒操作说明提取纤维血管膜组织中的全蛋白样品，进行蛋白质印迹实验分析[8]。取全蛋白样品，加入浓度为10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，设置电压为80～120 V，分离蛋白质30～60 min。随后，加入NLRP3和Caspase-1单克隆抗体于4 ℃的恒温环境下孵育24 h，检测纤维血管膜组织NLRP3和Caspase-1相对表达含量。另外，以GAPDH作为对照。

1.2.5 血管拟态标志物水平检测：通过Western blot法检测标本中血管拟态标志物水平，包括血管内皮生长因子A(VEGF-A)、血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)、Eph受体酪氨酸蛋白激酶2(EphA2)和基质金属蛋白酶(MMP)[9]。具体操作如下：向纤维血管膜组织中加入RIPA细胞裂解液将组织细胞裂解，然后进行电泳分离，转膜。加入浓度为5%的脱脂牛奶于室温下封闭1 h。加入一抗(VEGF-A、VE-cadheri、EphA2、MMP-2、MMP-9和GAPDH)在4 ℃环境中孵育过夜。TBST缓冲液在室温下振荡清洗3次，10 min/次；再加入二抗于室温下孵育1 h，TBST室温振荡清洗3次，10 min/次。显色处理得到的图像用Image J软件进行数据分析。

2 结 果

2.1 两组患者一般资料比较 两组性别、年龄、体重指数等一般资料对比均无统计学差异(均P>0.05)，见表1。

表1 两组患者一般资料比较

2.2 两组患者新生血管密度比较 试验组患者新生血管数为+～级别的患者占84.21%，级别的患者占15.79%；对照组患者新生血管数为+～级别的患者占7.41%，级别的患者占92.59%，两组患者不同级别新生血管数对比，差异具有统计学意义(P<0.01)。对比两组患者的新生血管密度，试验组小于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 两组患者新生血管密度比较

2.3 两组患者NLRP3炎症小体表达水平比较 试验组患者NLRP3和Caspase-1相对表达水平均高于对照组，差异具有统计学意义(均P<0.01),见表3。

表3 两组患者NLRP3炎症小体表达水平比较

2.4 两组患者血管拟态标志物水平比较 试验组患者VEGF-A、VE-cadheri、EphA2、MMP-2、MMP-9相对表达水平均高于对照组，差异具有统计学意义(均P<0.01)，见表4。

表4 两组患者血管拟态标志物水平比较(pg/ml)

3 讨 论

糖尿病引起的视网膜病变，尤其是增殖性糖尿病性视网膜病变目前已经成为眼科面临的棘手问题。临床研究表明，机体的免疫炎症反应与新生血管的形成之间存在密切的关系，包括肝脏、肺部、肾脏以及脑部疾病等[10]。炎症反应的发生和发展是促进新生血管形成的关键性因素。研究证实在糖尿病性视网膜病变中免疫炎症反应能够促进病理性新生血管的生成[11-12]。NLRP3炎性小体在体内主要参与机体各种疾病的发生发展过程。首先当病原体以及炎症因子等危险信号出现时，会启动NLRP3炎性小体，然后NLRP3炎性小体就会发生寡聚化，同时募集相关反应蛋白[13-14]。NLRP3作为近年来发现的一种参与免疫炎症反应的重要因子，其与多种疾病的发生和发展存在密切的相关性，目前研究较多的是NLRP3在免疫系统疾病中发挥的作用[15]。有关NLRP3参与糖尿病视网膜病变的发生发展过程的研究相对较少。

通过调研文献[16-17]可知，大量的细胞和糖尿病性视网膜病变动物模型实验结果表明，NLRP3炎症小体及其信号通路参与了视网膜细胞凋亡、血管通透性增加以及视网膜功能降低的发生发展过程。通过临床检测数据发现[18]，糖尿病性视网膜病变患者外周血单核细胞NLRP3表达水平显著高于健康受试者，且糖尿病视网膜病患者的视网膜纤维血管膜中NLRP3表达水平也显著高于健康受试者。糖尿病视网膜病变患者玻璃体内存在NLRP3炎症小体，在糖尿病视网膜病变患者中，其他炎症因子如IL-18也随着NLRP3表达水平的增高显著增多；与非糖尿病性视网膜病变患者相比，糖尿病性视网膜病变患者玻璃体内NLRP3表达水平更高，因此认为NLRP3炎症小体参与了糖尿病性视网膜病变的病理过程。与上述研究相符，本研究也发现，试验组患者新生血管数为+～级别的患者高于对照组，而级别的患者则小于对照组，差异具有统计学意义；试验组患者新生血管密度小于对照组，差异具有统计学意义；试验组患者NLRP3和Caspase-1相对表达水平高于对照组，差异具有统计学意义。

血管拟态标志物是近年来被发现的存在于多种免疫系统疾病内的一种新的血液供应方式，常用于鉴定是否具有形成血管生成拟态的能力[19]。在血管生成拟态过程中，血管拟态标志物会受到炎症因子的影响，视网膜细胞及其新生血管的形成也与血管拟态标志物的水平有关，包括VEGF-A、VE-cadherin、EphA2和MMP等。已有研究表明，VEGF-A、VE-cadherin、EphA2可能是糖尿病性视网膜病变生成拟态的重要调节物质。本研究结果表明，试验组患者血管拟态标志物VEGF-A、VE-cadheri、EphA2、MMP-2、MMP-9表达水平均高于对照组，差异具有统计学意义。

目前，糖尿病性视网膜病变的治疗主要包括控制血糖、血脂、血压等全身治疗以及眼科局部的治疗等。其中，眼科局部治疗包括视网膜激光光凝、眼内注射抗VEGF(血管内皮生长因子)药物和激素、以及玻璃体切割手术治疗等[18]。但是，目前能够直接用于治疗糖尿病性视网膜病变的药物仍然有限，主要集中于抗VEGF和眼内激素抗炎方面，因此进一步开发治疗糖尿病性视网膜病变药物尤为重要。NLRP3炎症小体被认为是影响糖尿病性视网膜病变新生血管形成的关键因素之一，抗炎药物治疗糖尿病性视网膜病变已成为靶向治疗的新选择。目前已发现多种药物能够抑制NLRP3炎症小体的活化，包括非诺贝特和米诺环素等通过作用于不同的通路来抑制NLRP3炎症小体的激活，缓解高血糖给视网膜带来的危害[20]。因此将NLRP3炎症小体作为治疗糖尿病性视网膜病变的新靶点，有重要的研究价值及广阔的应用前景。

综上所述，NLRP3炎症小体显著影响糖尿病视性网膜病变晚期新生血管形成和血管拟态标志物的表达。NLRP3炎症小体作为一种重要的蛋白复合物，其在各种疾病的发生发展中的作用机制复杂。目前关于NLRP3炎症小体在糖尿病性视网膜病变发病中作用的研究相对较多，进一步研究其在糖尿病性视网膜病变发病中的分子机制以及相应的干预措施对于糖尿病性视网膜病变的防治具有重要的理论意义和应用价值。