PAICS基因促进乳腺癌细胞生长及其可能分子机制 ①
2021-11-16李彤彤赵小芳杜欣娜
夏 伟，沈 旋，李彤彤，庄 莹，赵小芳，张 虎，杜欣娜
(1.江苏医药职业学院医药生物技术研究院，江苏 盐城 224005；2.江苏医药职业学院基础医学部，江苏 盐城 224005)
乳腺癌(Breast cancer, BC)是一种常见的危害女性健康的恶性肿瘤，自20世纪70年代末开始全球乳腺癌发病率一直呈上升趋势[1]。2020年全球最新癌症报告显示，全球乳腺癌新发病例高达226万例，超过了肺癌的220万例，乳腺癌取代肺癌，成为全球第一大癌。中国虽不是乳腺癌的高发国家，但乳腺癌发病率却位列女性恶性肿瘤之首[2～4]。尤其是近年，我国乳腺癌发病率的增长速度高出高发国家1～2个百分点，且呈现发病年轻化的趋势，严重威胁女性的身体健康和生活质量。
目前乳腺癌的病因尚未完全清楚，肿瘤细胞发生转移仍是癌症患者发生死亡的主要原因，这也使得乳腺癌成为难以治愈的恶性肿瘤之一。开发新的乳腺癌治疗的靶点为乳腺癌治疗开辟了新的治疗途径，由于它可以高效选择性地杀伤肿瘤细胞的同时，减少对正常组织的损伤，提高患者生存质量，极大地提高肿瘤的治疗效果，对于临床具有重要意义[5,6]。
磷酸核糖氨基咪唑羧化酶和磷酸核糖氨基咪唑琥珀酰酰胺合酶(Phosphoribosylaminoimidazole Carboxylase And Phosphoribosylaminoimidazolesuccinoc-
arboxamide Synthase, PAICS)是一种编码双功能酶的嘌呤生物合成基因，其N-末端含有磷酸核糖氨基咪唑羧化酶活性，C-末端含有磷酸核糖氨基咪唑琥珀酰胺合成酶活性[7]，是一种新的抗凋亡癌基因和信号转导的关键蛋白。Goswami等报道PAICS表达下调可以抑制卵巢癌的生长、增殖和迁移，增强细胞凋亡[8]。Chakravarthi等报道PAICS在前列腺癌中的表达显著上调，且在前列腺癌细胞增殖和侵袭中发挥重要作用，可作为有效的治疗靶点[9]，然而其在乳腺癌中的作用尚未得到研究。本研究通过肿瘤数据库大数据分析PAICS基因对乳腺癌细胞生的影响，并通过KEGG和GO分析其促癌潜在分子机制。
1 材料和方法
1.1 数据来源
乳腺癌中PAICS基因表达数据和临床特征数据均来源于肿瘤基因组图谱计划(The Cancer Genome Atlas, TCGA)数据库。TCGA数据库中收录了1085例乳腺癌患者的基因表达谱数据和临床随访数据。包括乳腺癌在内的癌症细胞生长依赖基因数据来源于DepMap数据库，该数据库收录了全基因组CRISPR-Cas9敲除文库筛选的包括乳腺癌细胞在内的700多种癌细胞的生长依赖基因。
1.2 分析方法
1.2.1 PAICS基因表达与临床特征相关性数据分析
登录癌症多组学和临床数据库LinkedOmics平台(http://www.linkedomics.org/)[10]，打开数据库搜索界面，癌症类型选择“TCGA_BRCA”，检索数据集选择“HiSeq_RNA”，基因名称输入“PAICS”，数据类型选择“Clincal”，PAICS统计方法选择“Non-parametric T test”，提交分析，下载结果。
1.2.2 PAICS基因敲除对乳腺癌细胞生长的影响
打开CRISPR-Cas9[11]全基因组敲除文库筛选数据(https://score.depmap.sanger.ac.uk/ downloads)，下载数据“broad_essentiality_matrices_190724.zip”，选择乳腺癌细胞系，分析PAICS基因敲除对乳腺癌细胞生长的影响，Graphpad Prism 7.0绘图。
1.2.3 泛癌分析PAICS对细胞生长的影响
登录DepMap[12]首页(https://depmap.org/po-
rtal/)，输入基因名称“PAICS”，数据集选择“CRISPR (Avana) Public 20Q1”，下载结果，Adobe Illustrator CC 2015处理图片。
1.2.4 PAICS共表达基因富集分析
下载乳腺癌组织中PAICS共表达基因：登录LinkedOmics首页，癌症类型选择“TCGA_BRCA”，数据集选择“HiSeq_RNA”，输入基因名称“PAICS”，靶向数据类型选择“HiSeq_RNA”，统计方法选择“Spearman correlation test”提交分析，下载PAICS共表达基因列表。
P<0.01，FDR<0.01，r>0.3的基因视为PAICS表达正相关基因,P<0.01，FDR<0.01，r<-0.3的基因为PAICS表达负相关基因。打开DAVID 6.8在线工具(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)，分别输入PAICS表达相关基因列表，进行KEGG信号通路和GO分析，下载结果，Image GP软件 (http://www.ehbio.com/ImageGP/)绘制可视化富集分析图形。
2 结果
2.1 乳腺癌中PAICS基因表达与临床特征关联性分析
大数据分析结果表明，肿瘤纯度、PAM50分子亚型、组织学类型影响PAICS基因的表达(P<0.001)，且PAICS基因表达差异与患者总体生存率相关联(P<0.01)。见表1。
表1 乳腺癌患者PAICS mRNA表达与临床特征关联性分析
2.2 PAICS基因敲除抑制乳腺癌细胞的生长
Behan及其研究团队于2019年进行了全基因组CRISPR-Cas9敲除文库筛选癌症细胞生存依赖基因的大规模实验，该实验筛选了源自30种癌症类型的324种细胞系的生长或生存依赖基因[11]。本研究挖掘上述实验研究数据，发现敲除PAICS基因可以抑制乳腺癌细胞系MCF7、CLA-51和MDA-MB-415的生长，见图1。
图1 PAICS基因敲除对乳腺癌细胞增殖的影响
2.3 泛癌分析PAICS基因敲除对细胞生长的影响
本研究通过癌症生存依赖基因数据库DepMap分析了PAICS基因敲除对癌细胞生长的影响，结果显示PAICS基因敲除可以影响包括多发性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病和乳腺癌等在内的多种肿瘤细胞的生长，见图2。
图2 泛癌分析PAICS基因敲除对细胞生长的影响
2.4 PAICS共表达基因GO和KEGG分析
利用TCGA搜索乳腺癌中PAICS共表达基因，并进行数据可视化。GO-BP分析表明，PAICS共表达基因参与多种生物学过程，包括细胞分裂(cell division)、DNA复制启动(DNA replication initiation)、微管运动(microtubule-based movement)、胞质分裂的正调控(positive regulation of cytokinesis)、细胞周期调控(regulation of cell cycle)等；GO-CC分析显示，PAICS共表达基因涉及的细胞定位包括细胞质(cytoplasm)、驱动蛋白复合体(kinesin complex)、胞浆核周区(perinuclear region of cytoplasm)、胞外间隙(extracellular space)等；GO-MF分析表明，PAICS共表达基因涉及的分子功能包括ATP结合(ATP binding)、单链DNA结合(single-stranded DNA binding)、poly(A)RNA结合(poly(A) RNA binding)、微管运动活性(microtubule motor activity)、信号转导活性(signal transducer activity)等。参与PAICS共表达基因的KEGG信号通路包括：细胞周期(cell cycle)、孕酮介导的卵母细胞成熟(progesterone-mediated oocyte maturation)、P53信号通路(P53 signaling pathway)、RNA聚合酶(RNA polymerase)、同源重组(homologous recombination)、cAMP信号通路(cAMP signaling pathway)等[12，13]。以上生物信息学分析结果表明，PAICS的下调在乳腺癌相关的生物学过程中起着重要作用，为乳腺癌生物标志物的研究提供了线索。见图3。
图3 PAICS共表达基因GO和KEGG分析PAICS
3 讨论
乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤之一，尽管以手术、放化疗、分子靶向治疗使乳腺癌的预后取得了很大发展，但肿瘤复发和迁移仍导致大量患者预后不良[11]。PAICS作为一种已被报道的抑癌基因，其高表达能够促进前列腺癌和卵巢癌的发展。但到目前为止，尚未发现PAICS在乳腺癌中表达的表型特征，其对乳腺癌发生和侵袭的影响以及相关分子机制尚不清楚。本研究利用公共数据库Linkedomics、TCGA 数据库 和 cBioPortal等，综合分析了乳腺癌患者PAICS表达水平与临床意义的关系，明确与之相关的调控基因。从而为乳腺癌的临床诊断和预后判断发现新靶点提供理论依据，对进一步改善乳腺癌的治疗将具有重要意义。
研究结果显示PAICS表达与乳腺癌患者的肿瘤纯度、PAM50分子亚型、组织学类型和总生存率等临床病例特征均具有相关性，说明PAICS参与了BRCA疾病进展。进一步生物信息学实验表明，敲除PAICS可显著抑制乳腺癌细胞MCF7、CLA-51、MDA-MB-415的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡。Depmap数据库显示敲除或沉默PAICS基因，也能限制抑制乳腺癌细胞系的增殖。共表达分析显示这些差异表达基因主要是影响乳腺癌的上调和下调基因。在GO和KEGG分析中，这些差异表达基因主要涉及细胞外基质区域和刺激反应。据报道，从头嘌呤途径以及核糖体和核仁的生物发生是维持肿瘤细胞转录、复制和细胞分裂。而PAICS正是一种关键的从头嘌呤代谢酶，可产生N-琥珀酸酰胺-6-氨基咪唑核苷酸(SAICAR)。本研究发现，与PAICS共表达的基因主要集中在细胞增殖相关的过程中，如细胞分裂、有丝分裂核分裂、DNA结合等[14]。以上诸多证据表明，PAICS在促进乳腺癌的发生、发展和转移过程中扮演着重要作用，可能成为抗肿瘤治疗的有力靶点[15,16]。
本研究主要通过生物信息学软件验证乳腺癌与PAICS表达相关性，结果提示敲低PAICS基因可能影响乳腺癌的增殖，但是PAICS在乳腺癌复发中的调控机制还未明确，PAICS高表达的基因富集分析结果有待深入研究，同时本研究仍缺乏相关实验验证，接下来我们会通过体外实验进一步验证PAICS是否能够成为抗肿瘤治疗的新靶点。
