发作性运动诱发性运动障碍患者PRRT2基因突变的研究 ①

朱金玲，张游侠，孙 权，顿圆圆，金绍静

(佳木斯大学基础医学院,黑龙江 佳木斯 154007)

发作性运动诱发性运动障碍(Paroxysmal Kinesigenic Dyskinesia, PKD)(MIM 128200)是发作性运动障碍(Paroxysmal dyskinesia)中的最常见的一种，是唯一已知的以休息时突然运动(如开始行走或从坐姿上升)引起的单侧或双侧不自主运动为特征的疾病,大多在儿童或青年期发病，发作时以异常运动或异常姿势改变为特征，如肌张力障碍、舞蹈样动作、手足徐动和投掷样动作等，每次持续时间较短，一般在一分钟以内。PKD发病具有高度异质性，大部分研究认为与遗传有关，随着分子生物学技术的发展，2011年,Wang等人[1,2]克隆了富含脯氨酸的跨膜蛋白2(Proline-rich transmembrane protein2，PRRT2)基因，并发现该基因是婴儿惊厥性阵发性运动诱发运动障碍(PKD/IC)的主要致病基因。有研究发现PRRT2基因突变与良性家族性婴儿癫痫和热惊厥相关癫痫、偏瘫性偏头痛和阵发性共济失调有关[3,4]。最近有研究报道PRRT2与突触小体相关蛋白SNAP25相互作用,可能参与神经递质的释放,影响突触传递[5],但其发生机制有待于进一步研究。PRRT2在中国、日本、亚洲、非洲和高加索人群体中被描述为PKD、PKD/IC和BFIE的致病基因。我们的目的是评估中国人群中发作性运动诱发性运动障碍患者的PRRT2基因突变，为研究发作性运动诱发运动障碍的发病机制提供理论基础。

1 资料及方法

1.1 研究对象

收集2016～2020年佳木斯中心医院癫痫科就诊的患者散发病例14例，所有患者均为新病例，根据2004年Bruno等[6]提出的诊断标准进行诊断。30例健康对照组为体检中心提供。

1.2 引物设计

在Nucleotide数据库中检索PRRT2 人类DNA序列，选取外显子2的全序列，用Primer-Blaster在线设计引物，通过PCR实验筛选出扩增效率较好的一对引物，引物序列如下 ：正向引物为CCAGAAACCACAGAGACCCC，反向引物为TAAGCGAAGGCCACGATGTT，扩增片段长度为665bp，引物序列送上海生工合成。

1.3 DNA 提取

北京百泰克生物技术有限公司全血基因组DNA提取试剂盒提取患者和正常人的基因组DNA(按说明书操作)，提取的DNA放4℃冰箱保存备用。

1.4 PCR 扩增

PCR反应体系:10μL的2×Power Taq PCR Master Mix，正向引物和反向引物各1μL，1μL的DNA模板， 12μL 的dH2O总体积为25μL。 PCR反应条件: 95℃ 预变性5min, 95℃变性45秒、58℃复性30秒、72℃延伸30秒、 30个循环， 最后延伸72℃C，5min，扩增产物长度665bp。

1.5 扩增产物凝胶电泳、纯化和测序

PCR扩增产物在2% 的琼脂糖进行凝胶电泳30min，EB染色，紫外灯下观察，根据DNA-Marker切取目的DNA部分的凝胶,然后用DNA纯化试剂盒纯化DNA，纯化后的DNA送上海生工测序。

1.6 测序分析

测得的序列应用Blaster在 GeneBank 数据库中与人类基因组中野生型PRRT2的 mRNA序列 (NM_145239.3)进行序列比对，并根据测序结果图找到突变位点，突变位点在SNP数库中找不到的为新发现突变点。

2 结果

14例患者中有5例患者检测到有热点突变c.846-847 insC (p.P217fsX)(见图1)，其中有一个患者同时携带有一个基因突变为c.906G>A (p.Glys237Arg)(见图2)；其余9个患者均检测到突变位点c.882G>A (p.Arg229 Lys)(见图3)，该突变为新发现基因突变，这9个患者中有5个患者同时携带有c.609C>G (p.Pro138Ala)突变(见图4)，30例正常人均没有发现突变。

图1 c.846-847 insC (p.P217fsX)突变

图2 c.906G>A (p.Glys237Arg)突变

图3 c.882G>A (p.Arg229 Lys)

图4 c.609C>G (p.Pro138Ala)

3 讨论

PKD是阵发性运动障碍中最常见的类型，也称为发作性运动诱发性舞蹈手足徐动症，是一类反复发作的非自主性运动障碍疾病，PKD在人群中发病率较低，占世界人口的1/15万。 PKD 常于儿童或青少年期发病，发病具有高度异质性，大多为原发性，有遗传家族史的病例约占60%，其遗传方式大多为常染色体显性遗传。根据人类基因突变数据库(The Human Gene Mutation Database，HGMD)，截止到2018年2月，已报道的PRRT2基因突变总计93种[7]。PRRT2基因编码由N端胞外结构域和C-胞质结构域组成的跨膜蛋白，在脑中高表达。 PRRT2基因 突变是PDK的致病因素，该基因定位于16p11.2-q12.1区带，该区域编码离子通道蛋白。最近有研究报道PRRT2与突触小体相关蛋白SNAP25相互作用,可能参与神经递质的释放,影响突触传递[5],进而影响脑功能的改变。PKD与癫痫可能有共同的生物学基础，其病理生理机制之一很可能与离子通道缺陷有关。少数继发性PKD可见于多发性硬化症或脑梗死，还有脑外伤、产期缺氧性脑病、糖尿病、低血糖、甲亢等也可以引发PKD的发生。该病经常被误诊为癫痫，因小剂量抗癫痫药物治疗有效，如卡马西平、奥卡西平、苯妥英钠、拉莫三嗪等均能减少或终止发作。

临床观察证实原发性PKD是受遗传因素强烈影响的神经发育障碍性疾病。自PRRT2基因被证实为家族性PKD的致病基因以来，迄今为止在PKD患者中已发现约30种PRRT2基因突变。我们对14例PKD 患者PRRT2基因第2外显子进行测序，发现1个移码突变和3个错义突变。其中c.846-847 insC (p.P217fsX)为热点突变，c.882G>A (p.Arg229 Lys)为新发现的突变，在SNP基因组数据库中未检测到。且14例散发病例中有9例携带有此突变(64.3%)，所发现的突变在健康人中均没有发现，为此我们推测p.Arg229 Lys突变可能是PKD的致病基因，但其发病机制有待于进一步研究。我们的研究结果发现有些患者携带有双重突变，有研究报道PRRT2基因双重突变可导致智力缺陷[8]，该研究推测PRRT2突变患者的表型差异可能取决于PRRT2突变类型。我们下一步将研究患者的临床表型与突变之间的关系。

总之我们的研究发现了一个新的点突变,扩大了PKD发病的基因谱,为阵发性运动障碍疾病的诊断提供了新的检测突变点。