板蓝根花叶病病原分子鉴定△

魏若凡，王蓉，李勇，丁万隆

中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193

板蓝根Isatidis Radix 是十字花科植物菘蓝Isatis indigoticaFort.的干燥根，具有清热解毒、清凉利咽之功效[1]。近年来，板蓝根病毒病频发，成为影响板蓝根产量和药用品质的重要病害。2020 年9 月，在对安徽省太和县板蓝根进行病害调查时发现板蓝根花叶病，其症状表现为叶片皱缩、花叶，根系变小，病害发生率为5%～10%。目前，已鉴定出板蓝根花叶病的病原包括黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）和蚕豆萎蔫病毒2 号（broad bean mosaic virus 2，BBWV2）[2-3]。另外，马铃薯Y 病毒属（Potyvirus）也是引起花叶病的一类重要病原，可能造成板蓝根花叶病[4]1069。通过对病毒外壳蛋白（coat protein，CP）基因进行序列测定、BLASTn 分析和系统发育进化树构建，分析病毒的序列特征和分类地位，为板蓝根花叶病的监测和防控提供参考。

1 材料

1.1 样品

板蓝根花叶病病叶于2020 年9 月采集自安徽省太和县（N33°30′54″，E115°31′28″，海拔40 m），叶片呈现黄绿相间的花叶症状并出现皱缩（图1），由中国医学科学院药用植物研究所王蓉副研究员鉴定为板蓝根花叶病病叶，编号为BLG1～BLG5。

图1 板蓝根花叶病田间症状

1.2 试药

TRNzol（批号：R6801）、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂（批号：U8908）、质粒小提试剂盒（批号：U8904）均购自天根生化科技（北京）有限公司；M-MLV 反转录酶（批号：AG70412A，北京拜尔迪生物技术有限公司）；pMD19-T Vector（批号：AHF1958A）、T4 DNA Lingas（批号：AKE2060A）、Ex TaqDNA polymerase（批 号：AJE0795A）、RNase Inhibitor（批号：AH40401A）均购自大连宝生物股份有限公司；dNTPs（批号：N10219）、random hexamers primer（批号：K31126）、Oligo（dT）18（批号：K20608）、大肠杆菌DH-5α 感受态细胞（批号：N1290610）均购自北京全式金生物技术有限公司。引物合成和序列测定由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.3 仪器

Fresco 21 型冷冻高速离心机［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；Research plus 型移液器（Eppendorf 公司）；T100 型基因扩增仪（Bio-Rad 公司）；ChampGel 5000 型全自动凝胶成像仪（北京赛智创业科技有限公司）；DYY-6C 型电泳仪、DYCP-31E 型电泳槽均购自北京市六一生物科技有限公司；DH6000型电热恒温培养箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；DK-8D 型电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司）；YT-CJ-1D 型超净工作台（北京亚泰科隆仪器技术有限公司）；ZHWY-100H 型恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。

2 方法

2.1 叶片总RNA提取

参照TRNzol Universal总RNA 提取试剂说明书，使用TRNzol 试剂提取板蓝根叶片总RNA，获得的总RNA置于-80 ℃保存备用。

2.2 RT-PCR检测

以1 μg总RNA为模板，random hexamers primer为引物，在M-MLV 反转录酶作用下合成RNA 链的互补cDNA 链。反应体系及操作步骤参照M-MLV 反转录酶使用说明书。获得的cDNA 置于-20 ℃保存备用，用于CMV、BBWV2 和Potyvirus检测，检测引物参照文献合成[5-7]，扩增区域均为病毒的CP基因（表1）。取聚合酶链式反应（PCR）产物5 μL，1%琼脂糖凝胶电泳。使用琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒纯化回收目标条带并将目标条带连接到pMD19-T 载体，每个片段选取3 个阳性克隆送至北京擎科生物科技有限公司测序。

表1 板蓝根花叶病病毒检测引物

2.3 CMV CP序列比对分析

序列比对分析采用DNAMAN 6.0软件和美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLASTn 程序。GenBank 数据库下载13 个代表性CMV 株系/分离物，使用MEGA X软件[8]中的ClustalW程序进行序列比对，使用邻接法（neighbor joining，NJ）根据CMV CP 氨基酸序列构建系统发育进化树，Bootstrap 法（重复数为1000）评估系统发育进化树。花生矮化病毒（peanut stunt virus，PSV）的ER 株系（PSV-ER）作为远源关系参照。

3 结果

3.1 RT-PCR检测结果

经RT-PCR，CMV 特异引物在BLG1～BLG5 中均扩增到1 条657 bp 的条带（图2）。BBWV2 特异引物和Potyvirus简并引物在上述样品中未扩增到条带。将BLG3、BLG4 扩增条带回收纯化，连入pMD19-T 载体进行测序，获得AH-BLG3 和AHBLG4 分离物序列（GenBank 登录号：MW251398和MW251399），2 条片段均包含完整的CP基因，预计编码218 aa。序列比对分析发现，AH-BLG3 和AH-BLG4 分离物核苷酸和氨基酸序列相似度分别为99.39%和100%。BLASTn分析结果显示，AH-BLG3和AH-BLG4 与我国白术上的CMV ZJAm 分离物（MK421103）相似度最高，核苷酸相似度分别为99.54%和98.93%，氨基酸相似度均为100%。上述结果明确了安徽省太和县板蓝根花叶病的病原为CMV。

图2 RT-PCR检测CMV

3.2 CMV安徽板蓝根分离物系统进化分析

基于CMV CP 氨基酸序列构建系统发育进化树显示，上述所有CMV分离物分为Ⅰ组和Ⅱ组，其中Ⅰ组又可分为ⅠA 和ⅠB 亚组[9-10]。其中，AH-BLG3和AH-BLG4 分离物均属于ⅠB 亚组，与白术ZJAm分离物和玉米Anhui 分离物聚为一支，亲缘关系最近。AH-BLG3 和AH-BLG4 与北京地区板蓝根上分离到的CMV-Ii 分离物分属ⅠB 亚组的不同分支（图3）。

图3 基于CMV CP氨基酸序列的NJ系统发育进化树

比较安徽省和北京地区板蓝根CMVCP序列发现，AH-BLG3 和AH-BLG4 与CMV-Ii 分离物核苷酸序列相似度分别为98.17%和97.87%，氨基酸序列相似度均为99.08%，氨基酸在第91 位（T/L）和第168位（H/Y）存在差异（图4）。

图4 板蓝根CMV分离物CP氨基酸序列比对

4 讨论

植物病毒病是威胁药用植物产量和品质的重要病害，病原种类繁多且复杂。1 种药用植物可以受到多种病毒侵染，如太子参花叶病的病原有CMV、BBWV2、芜菁花叶病毒（turnip mosaic virus，TuMV）和烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）[11]；1 种病毒也可危害多种药用植物，如CMV 可侵染百合[12]、半夏[13]、三七[14]、白术[15]、柴胡[16]、丹参[17]、薄荷[18]等100 余科1200 余种植 物[2]。BBWV2 可侵染毛地黄[19]、柴胡[16]、白术[20]等药用植物。马铃薯Y 病毒属是植物病毒中最大的属。该属病毒可侵染多种药用植物。例如，TuMV 可侵染太子参[11]、金莲花[21]；马铃薯Y 病毒（potato virus Y，PVY）可侵染怀山药[22]、菊花[23]；芋头花叶病毒（dasheen mosaic virus，DsMV）可侵染半夏、天南星等[24]。

板蓝根是清热解毒类中药的代表。近年来，常有板蓝根花叶病的报道，本研究使用CMV、BBWV2的特异性检测引物和Potyvirus的简并引物，通过RT-PCR 方法对安徽省太和县板蓝根花叶病的病原进行鉴定，确定其病原为CMV，属于ⅠB 亚组。逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测板蓝根花叶病也存在一定的局限性。该方法仅能检测特定病毒，板蓝根叶片中是否还有其他病毒需通过高通量测序进一步确认。

药用植物病毒病的检测方法主要有生物学检测、电子显微镜检测、血清学检测、分子生物学检测等。徐洁[25]用普通烟草、洋酸浆等检测侵染马铃薯的PVY；李明军等[22]用电子显微镜检测出侵染怀山药的PVY；吴志明等[17]用DAS-ELISA 试剂盒检测到侵染丹参的CMV；王宝霞等[3]用非依赖性PCR 和RT-PCR 检测出侵染板蓝根的BBWV2。各检测方法有各自的优缺点。在实际工作中，应根据不同的检测条件及检测目的，选择合适的检测方法。

植物病毒病的防治主要以预防为主，植株一旦发病，无有效的防治药剂。防治方法主要有：1）对种子、种苗和无性繁殖材料进行检验和检疫；2）通过茎尖组织培养进行脱毒；3）选育抗病品种；4）加强田间管理，培育壮苗；5）防治介体昆虫，防止病毒传播等[26]。自然界中CMV 主要通过蚜虫等虫媒以非持久方式传播，也可通过机械传播[4]965。因此，板蓝根种植过程中应特别注意加强传毒媒介的防治，及时清除带毒植株，机械收割大青叶时注意农具消毒。板蓝根多以种子繁殖，仍需实验证明CMV 是否通过板蓝根种子传播。本研究结果证明，不同产区的板蓝根植株携带的病毒具有地域特异性，生产上应加强不同板蓝根产区病毒病发生及为害情况监测。