基于网络药理学的补肾和脉方治疗高血压作用机制研究△

张李慧，苏文革

1.山东中医药大学，山东 济南 250014；2.山东中医药大学 附属医院，山东 济南 250011

我国高血压人口调查结果显示，近30 年，高血压患病率不断上升，目前约有30%的成年人患有高血压[1-4]。由于高患病率和伴随的血管风险，高血压是中国脑血管疾病（CVD）死亡的最重要原因之一[4]。多项研究结果表明，高血压治疗率和控制率分别低于50%和20%[5-11]，因此，对其的防控成为一项国家公共卫生重点工作[12]。

根据患者头晕、头痛、眩晕等主要临床证候，高血压属于中医学“眩晕”“头痛”范畴[13]；如果以心慌、胸闷、胸痛为主要临床表现，则属于“心悸”“胸痹”范畴；如果患者出现突然昏仆、神志模糊不清、抽搐、半身不遂、口舌歪斜等症状，就属于“中风”范畴。中医上本病以肝肾阴阳失调为本，风、火、痰、瘀为标。治疗原则以调整阴阳、补虚泻实为主。虚证者以肝肾阴虚为主，采用滋补肝肾；实证者根据具体情况分别施以潜阳、泻火、化痰、逐瘀等法[13]。

补肾和脉方（生黄芪、黄精、桑寄生、淫羊藿、炒杜仲、女贞子、怀牛膝、泽泻、川芎、当归、地龙）是在传承山东中医药大学附属医院周次清教授“从肝肾分期论治高血压”专病学术思想的基础上，通过长期临床实践和系列化的临床研究，依据补肾经方肾气丸、调肝经方当归芍药散合方而开发的现代制剂，多项临床研究表明，其可以有效降低收缩压和缩小脉压，延缓动脉硬化进程，形成了局部降压优势，具有更全面的心血管保护效应[14-18]。但中药具有多组分特性，其作用于机体的机制也相对复杂，通过动物实验或细胞实验的方法研究中药分子机制相对困难，而且会耗费大量人力物力。系统生物学的发展为明确中医药发挥疗效的分子机制提供了新的研究思路[19-21]。因此，本研究基于网络药理学的方法，分析补肾和脉方的有效活性成分和作用靶点，进一步预测补肾和脉方治疗高血压的靶点，并对相关靶点进行通路富集分析，探讨补肾和脉方治疗高血压的潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物活性化合物及其作用靶点预测

基于中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）预测补肾和脉方活性成分及作用靶点。将补肾和脉方中药物（生黄芪、黄精、桑寄生、淫羊藿、炒杜仲、女贞子、怀牛膝、泽泻、川芎、当归、地龙）输入TCMSP中，查询获得各味药活性成分，并基于吸收、分布、代谢、排泄（ADME）参数，按生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18进行筛选，获得药物活性成分。由于地龙未在TCMSP中获得有效成分，故未纳入此次分析研究中。再通过TCMSP查找药物活性成分的作用靶点，并于UniProt网站搜索得到每个成分靶点对应的靶标基因。

1.2 药物-成分-靶点网络构建

将上述各药物的化学成分及其作用靶点上传至Cytoscape 3.6.1 软件进行补肾和脉方药物-成分-靶点网络的构建。

1.3 疾病靶点检索

通过检索TTD 数据库（http://db.idrblab.net/ttd/）、OMIM 数据库（https://www.omim.org/）、DrugBank 数据库（https://www.drugbank.ca/）、GAD 数据库（https://geneticassociationdb.nih.gov/）、DisGeNET 数据库（https://www.disgenet.org/search）及PharmGKB 数据库（https://www.pharmgkb.org/），以“hypertension”为关键词进行高血压的疾病靶点检索。对从这6 个数据库获得的检索结果进行汇总、对比分析并取交集，最终获得高血压疾病相关靶标基因。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建

对1.1项下获得的补肾和脉方相关靶点和1.3项下获得的高血压相关靶点取交集，作为补肾和脉方治疗高血压病的靶点。然后上传至STRING 11.0数据库（http://string.embl.de/）进行处理，建立PPI网络。

1.5 网络拓扑分析

运用Cytoscape 3.6.1 软件对PPI 网络进行拓扑分析，筛选出核心靶点，即关键节点（Hub 节点）。对于PPI 网络中的每个节点，选择度（degree）[22]、介数中心性（betweenness centrality）[23]、接近中心性（closeness centrality）[24]3 个参数对网络中的节点进行评价。Hub节点的阈值是各参数对应的中值。

1.6 富集分析

通过基因富集分析在线工具DAVID 6.8 数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对获得的关键靶点进行基因本体（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。

2 结果

2.1 补肾和脉方活性成分筛选和靶点预测

通过TCMSP 检索获得补肾和脉方活性成分923 个，根据OB 和DL 条件进行筛选，得到有效活性成分110 个，部分活性成分信息见表1。对110 个活性成分进行靶点预测，最终得到166 个药物潜在靶点，部分靶点信息见表2。

表1 补肾和脉方部分活性成分信息

表2 补肾和脉方部分靶点信息

2.2 药物-成分-靶点网络构建

应用Cytoscape 3.6.1 对补肾和脉方活性成分及预测的作用靶点构建关系网络，见图1。

图1 补肾和脉方药物-成分-靶点网络

2.3 高血压相关靶点

由TTD、OMIM、DrugBank、GAD、PharmGKB、DisGeNET 检索得到高血压病相关靶点分别为66、200、166、747、129、277 个，去重后为1169 个，包括花生四烯酸盐5-脂氧合酶（arachidonate 5-lipoxygenase，ALOX5）、前列腺素G/H 合成酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、转录因子AP-1（transcription factor AP-1，JUN）、表皮生长因子（pro-epidermal growth factor，EGF）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）等靶点。

2.4 PPI网络构建

通过成分靶点与疾病靶点取得交集得到关键靶点83 个，上传至STRING 数据库进行处理，由于靶点基因PDE3A 与其他靶点未建立起联系，故删除，其他82个相关靶点建立PPI网络。

2.5 网络拓扑分析

将PPI网络上传至Cytoscape 3.6.1，共82个点，693 边，进行拓扑特征分析。以度、介数中心性和接近中心性3 个主要参数为基础，选取中值以上的靶点作为关键靶点，构建补肾和脉方治疗高血压作用的Hub 节点。经过2 次筛选后，得到11 个节点和43条边，PPI网络的拓扑筛选过程见图2。

图2 补肾和脉方治疗高血压PPI网络拓扑分析

11个节点及其度值分别为IL-6（40）、内皮型一氧化氮合酶3（NOS3，39）、肿瘤坏死因子（TNF，35）、表皮生长因子（EGF，35）、VEGFA（34）、前列腺素G/H 合成酶2（PTGS2，34）、过氧化氢酶（CAT，33）、乙酰胆碱酯酶（ACHE，31）、转录因子AP-1（JUN，30）、钠依赖性血清素转运体（SLC6A4，29）和凝血酶（F2，26），并体现在网络图中，这11个节点是该网络的关键靶点（图3）。

图3 补肾和脉方治疗高血压关键靶点PPI网络

2.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

利用DAVID 6.8 数据库，将2.4 项下83 个关键靶点基因上传并进行富集分析。GO分析包括分子功能（MF）、生物过程（BP）和细胞成分（CC），共得到315个GO条目（P≤0.05），其中与BP相关的条目最多，根据错误发现率（FDR）≤0.05 筛选，确定28个条目与BP相关，前20个BP条目主要涉及腺苷酸环化酶激活的肾上腺素能受体信号通路（adenylate cyclase-activating adrenergic receptor signaling pathway）、药物反应（response to drug）、缺氧反应（response to hypoxia）、磷脂酶C 激活的G蛋白偶联受体信号通路（phospholipase C-activating G-protein coupled receptor signaling pathway）、血管收缩的正调节（positive regulation of vasoconstriction）等生物分析过程，见表3。

表3 补肾和脉方治疗高血压靶点的GO生物过程分析

KEGG共得到53条信号通路，符合P≤0.05的有45 条，列举前20 条通路，见表4。其中同时符合FDR≤0.05的通路主要涉及神经活性配体-受体相互作用通路（neuroactive ligand-receptor interaction）、钙信号通路（calcium signaling pathway）、5-羟色胺能突触通路（serotonergic synapse）、环磷酸鸟苷-蛋白激酶信号通路（cGMP-PKG signaling pathway）、环磷酸腺苷信号通路（cAMP signaling pathway）、药物代谢-细胞色素P450通路（drug metabolism-cytochrome P450）、TNF 信号通路（TNF signaling pathway）、化学致癌通路（chemical carcinogenesis）8条。

表4 补肾和脉方治疗高血压靶点的KEGG富集分析

3 讨论

补肾和脉方是杨传华教授基于老年高血压病“肾气亏虚为本、血脉自病为标”的病机观和“补肾气、和血脉”治法观创制而成，方中桑寄生、淫羊藿和黄芪填精益髓补肾，共为君药，黄精、女贞子、炒杜仲滋补肝肾，与渗湿泄浊之泽泻、行气活血之川芎共为臣药，佐以补血活血之当归、引血下行之怀牛膝、清热熄风通络之地龙，共同起到补肾益精、活血疏肝之效，临床用于防治高血压病，疗效较理想[14,16,25-26]。大多数高血压患者的确切病因仍未知，中枢神经信号传导失调、肾功能不全和血管反应性改变都与此有关，但这些异常如何发生及如何相互作用产生临床高血压的机制尚未明确。高血压常伴随着炎症过程，免疫细胞在其中渗透并改变肾脏和血管的功能和结构。这种炎症反应不仅促进血压升高，而且还促进与高血压相关的终末器官损伤[27]。其次，高血压发病还与遗传、饮食、应激、肥胖等相关，具体机制尚未完全阐明，目前公认的有交感神经系统活性亢进、水钠潴留、肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）激活、内皮功能异常等[28]。

本研究通过PPI 拓扑分析发现，IL-6、NOS3、TNF、EGF、VEGFA、PTGS2 等可能是补肾和脉方治疗高血压的核心靶点。IL-6 及TNF 是机体重要的炎症因子，参与炎症反应，其水平降低可能减缓高血压的进程[29-30]。在高血压的发病中，血管平滑肌细胞异常增殖和肥厚占有十分重要的地位。NOS3 是合成一氧化氮（NO）的关键酶，NO 为内皮舒张因子，可以舒张血管、抑制血管平滑肌细胞增殖，进而改善血压[31]。EGF 及VEGFA 都是生长因子，能够促使细胞增殖，其中VEGF 水平升高是新生血管形成的生物标志物[32]。PTGS2 可与分布在血小板和内皮细胞上的前列环素受体G 蛋白偶联受体联结合激活G 蛋白，引起细胞内cAMP 水平升高，能够抗血小板凝集，松弛血管平滑肌，参与血管的舒缩功能[33]。因此，结果提示，补肾和脉方可能通过作用于这些核心基因，参与其生物过程而起到降压作用。

得到的KEGG 通路涉及cAMP信号通路，cAMP是多种血管活性物质的第二信使，一些舒血管物质（多巴胺、前列腺素E2、前列腺素I2等）可使肾内cAMP 水平升高，从而拮抗血管紧张素Ⅱ的缩血管效应[34]。而钙信号通路可能通过选择性阻滞钙离子内流呈现降压作用[35]。结合GO-BP 分析结果，及拓扑的核心靶点，推测补肾和脉方治疗高血压的潜在机制主要涉及抗炎、RAAS 系统、钙拮抗剂作用、舒张血管及改善内皮功能等方面。

综上分析，本研究运用网络药理学的方法，构建了补肾和脉方成分靶标-高血压疾病靶标网络，揭示出补肾和脉方治疗高血压的潜在作用机制，结果表明，其治疗高血压是多靶点、多途径的直接或间接协同作用，为其临床应用及进一步的药理学研究提供参考。