红景天特征图谱的建立及不同品系之间差异的研究△

徐智玮，宋霞，李永鹏，吴立斌，刘亚蓉，贾守宁*，李亚伟，李啟恩，武嘉庚

1.青海省中医院，青海 西宁 810000；2.青海药品检验检测院，青海 西宁 810016；3.青海大学 藏医学院，青海 西宁 810016

红景天为藏医常用药材，藏语为“索罗玛布”，用于肺脏热疾等证的治疗。藏医药用红景天最早记载于《四部医典》[1]。《晶珠本草》记载：“红景天活血清肺、止咳退烧、止痛，用于治疗肺炎、气管炎、身体虚弱、全身乏力、胸闷、难于透气、嘴唇和手心发紫。”[2]藏药中红景天基原较为混乱，《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版[3]收载品种为大花红景天Rhodiola crenulata（HK.f.et Thoms.）H.Ohba；而《藏药志》[4]和《青海省藏药标准》[5]中记载当地习用红景天主要为2 种，分别为藏译名“噶都尔曼巴”，即狭叶红景天R.kirilowii(Regel)Maxim.；藏译名“索罗玛保”，即唐古红景天R.algida（Ledeb.）Fisch.et Mey.var.tangutica（Maxim.）S.H.Fu。笔者也从市场调查中发现，主流品种以大花红景天和其代用品小花红景天为主。经考证发现，小花红景天基原主要以长鞭红景天R.fastigiata（Hk.f.et Thoms.）S.H.Fu 为主；而小花红景天药材外观与正品相似，占领了低价格红景天市场[6]。目前，围绕小花红景天开展药理实验的文献资料很少，而且这类藏药品种中“同名异物”“同物异名”的现象较多，也导致同属不同品种植物中主要药效成分存在差异，达不到稳定的质量和疗效。昝珂等[7]研究表明，以山栀苷甲酯和8-O-乙酰山栀苷甲酯为指标成分对独一味药材进行质量控制，不能达到区分市场上独一味及其伪品的目的，尤其是对采用伪品投料生产的制剂更难以控制。俞森[8]研究认为，不同品种大黄的高效液相色谱法（HPLC）得到的色谱图存在较大差异。汪荣斌等[9]对甘肃不同产地5 个种的秦艽药材进行活性成分含量比较研究，发现同种秦艽中，栽培品的龙胆苦苷含量均高于野生品，并且在不同品种间也有较大差异。因此，有必要建立起红景天药材的特征图谱，研究不同品种红景天成分之间的差异。

本实验收集不同产地、不同品种正品（大花红景天）、习用品（唐古红景天、狭叶红景天）和代用品（长鞭红景天）共29 批，考察红景天中2 个含量较高的有效成分红景天苷和没食子酸，并以其作为主要评判标准，建立红景天特征图谱，采用化学计量学分析方法进行深入研究，以期为红景天药材质量综合评价和利用提供参考。

1 材料

1.1 仪器

美国Waters（ACQUITY-UPLC）超高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器；ACE Excei 2 C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，2 μm）；AE200 型电子天平、XS105DU型分析天平（梅特勒-托利多公司）。

1.2 试剂

对照品没食子酸（批号110831-201805，纯度：91.5%）、红景天苷（批号110818-201804，纯度：98.8%）购自中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯）、无水甲醇（色谱纯）均购于Merck 公司；磷酸（分析纯，西陇化工股份有限公司）；超纯水（Millipore公司）。

1.3 药材

大花红景天Rhodiola crenulata（HK.f.et Thoms.）H.Ohba、狭叶红景天R.kirilowii（Regel）Maxim.、唐古红景天R.algida（Ledeb.）Fisch.et Mey.var.tangutica（Maxim.）S.H.Fu、长鞭红景天R.astigiata（HK.f.et Thoms.）S.H.Fu 药材经青海省中医院中药基础研究所赵国福主任中药师鉴定其基原准确。具体样品信息见表1。

表1 红景天药材来源信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为ACE Excei 2 C18（100 mm×2.1 mm，2 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1% 磷酸水溶液（B），梯 度洗 脱（0～15 min，4%A；15～20 min，4%～10%A；20～25 min，10%～15%A；25～30 min，15%～20%A；30～35 min，20%～22%A；35～40 min，22%～15%A；40～45 min，15%～10%A；45～50 min，10%～4%A）；体积流量为0.4 mL·min-1；柱温为30 ℃；检测波长为275 nm；进样量为5 μL。

2.2 对照品溶液制备

分别精密称取干燥至恒重的对照品没食子酸3.55 mg、红景天苷2.05 mg，分别置于25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，作为对照品储备溶液，使用时各精密量取1 mL 混合，即得没食子酸质量浓度为0.142 mg·mL-1、红景天苷质量浓度为0.082 mg·mL-1的对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取样品粉末约1 g，精密称定，置于100 mL 锥形瓶中，加50%甲醇100 mL，25 ℃超声（功率：250 W，频率：40 kHz）处理1 h，静置至室温，滤过，滤液先过0.45 μm 微孔滤膜，再过0.25 μm 微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 系统适用性考察 取供试品溶液（样品5），在2.1 项下色谱条件下进样分析，在此条件下各组分得到良好分离。

2.4.2 精密度试验 精密称取同一供试品（样品5）1 g，按2.3 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件连续进样6 次，以红景天苷为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD，结果各特征峰的相对保留时间<1%，单峰面积占总峰面积>2%的特征峰的相对峰面积<2%，采用Chem Pattern 2017 软件进行相似度分析评价，相似度为0.99，结果表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 精密称取同一供试品（样品5）1 g，按2.3 项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样5 μL，以红景天苷为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD，结果各特征峰的相对保留时间<1%，单峰面积占总峰面积>2%的特征峰的相对峰面积<2%，采用Chem Pattern 2017软件进行评价，相似度为0.99，表明供试品溶液24 h内稳定。

2.4.4 重复性试验 取同一批供试品（样品5）1 g，按2.3 项下方法各制备6 批供试品溶液，按2.1 项下色谱条件分别进样测定，记录色谱图。以红景天苷为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD，结果各特征峰的相对保留时间<1%，单峰面积占总峰面积>2%的特征峰相对峰面积<4%，采用Chem Pattern 2017 软件进行评价，相似度为0.99，表明该方法重复性较好。

2.5 红景天正品特征图谱的建立

取不同批次红景天正品（样品1～7）粉末1 g，精密称定，按2.3 项下方法制备供试品溶液，进样量为5 μL，分别记录UPLC 图（图1）。样品8、9 未知粉末各1 g 同法制备后进样，用于化学计量学分析。

图1 7批红景天正品UPLC图

2.6 特征峰的标定及相似度计算

采用Chem Pattern 2017软件进行数据分析处理，设定样品1 为参照图谱，将其他样品的色谱峰与参照图谱进行自动匹配，生成红景天正品的共有模式特征图谱（图2）。在共有模式特征图谱上标定12个特征峰，经过与对照品比对并结合光电二极管阵列（PDA）光谱，可知1 号峰为没食子酸，3 号峰为红景天苷。并计算样品1～7 与特征图谱的相似度，分别 为0.80、0.91、0.96、0.98、0.90、0.83、0.98，各批次的红景天正品之间相似度均大于0.8，说明正品红景天特征图谱相似度良好。

图2 红景天正品的共有模式特征图谱

2.7 红景天正品与习用品、代用品特征图谱比较

取不同批次红景天习用品、代用品粉末各1 g，精密称定，按2.3 项下方法制备供试品溶液，进样量为5 μL，分别记录UPLC 图（图3）。根据结果，采用Chem Pattern 2017 软件进行数据分析，计算红景天正品与习用品、代用品特征图谱相似度（表2），其中习用品狭叶红景天各批次的相似度平均值>0.80，唐古红景天各批次的相似度平均值>0.71；代用品长鞭红景天各批次的相似度平均值>0.77。

图3 红景天习用品、代用品UPLC图

表2 红景天正品、习用品及代用品相似度

2.8 化学计量学分析

2.8.1 聚类分析 采用多元统计分析中的聚类分析法对29 批红景天药材进行相似度分析，聚类分析参数选取欧氏距离和误差平方和法，各样本间距离的计算方法为夹角余弦，得出红景天聚类分析图（图4），由图4可知，1～8批样品相似度高，可以聚为大花红景天类，即8 号待测红景天为大花红景天；9～16 批样品可以聚为一类，为狭叶红景天类，即9 号待测红景天为狭叶红景天；17～23 批样品可以聚为一类，为唐古红景天；25～29 批样品可以聚为一类，为长鞭红景天。前3 种可聚为一大类，剩余长鞭红景天可以单独聚为一类。

图4 红景天药材聚类分析

2.8.2 主成分分析（PCA）采用Chem Pattern 2017 软件，以红景天正品共有模式特征图谱为参照模板，系统中添加其他品种红景天，最终生成4 种红景天共有模式特征图谱，见图5。将4种红景天共有模式特征图谱中的17 个特征峰峰面积作为输入变量用于PCA，结果见图6。由图6 可知，PC1 显示长鞭红景天和狭叶红景天样品为正值，载荷得分较高的为2号峰没食子酸；PC2显示大花红景天、部分批次唐古红景天为正值，部分唐古红景天为负值，载荷得分较高的为1 号峰红景天苷、7 号峰和13 号峰；PC3 显示狭叶红景天正值，载荷得分较高的为4 号峰。由此可以得知，1 号峰没食子酸、3 号峰红景天苷、4号未知峰、7号未知峰和13号未知峰是区分红景天品种的主要成分。13 号未知峰可以作为识别大花红景天的特征峰；7 号未知峰可作为识别唐古红景天的特征峰；4 号峰可以作为狭叶红景天鉴别的特征峰。不同批次的长鞭红景天中化学成分差异大于其他3种红景天。

图5 4种红景天药材共有模式特征图谱

图6 4种红景天药材共有模式下PCA

3 讨论与结论

3.1 实验条件优化

3.1.1 提取溶剂筛选 考察了蒸馏水、乙醇、甲醇作为溶剂提取红景天中的化合物，自然生长的红景天含有大量多糖物质，用水和乙醇作溶剂提取产物比较黏稠，不宜过分子膜，且进样后各峰之间分离度不好，杂峰较多。相比之下，甲醇的极性比乙醇大，甲醇提取物的溶解度要相对大一些，故选择甲醇作为红景天药材制备的溶剂。并在同一条件下考察30%、50%、70%甲醇及无水甲醇的分离效果，结果发现，样品在50%甲醇溶剂条件下出峰较多，且峰形较好。最终确定以50%甲醇为溶剂制备红景天药材样品溶液。

3.1.2 制备方法与优化 考察了超声提取法和加热回流法的提取工艺，发现加热回流法提取费时费力，提取的有效成分含量比超声提取法低。随后对超声条件进行考察，发现室温25 ℃下超声1 h效果好。

3.1.3 色谱条件的筛选与优化 考察了不同的流动相系统，如乙腈-水及《中国药典》2020年版规定的红景天中红景天苷检测流动相甲醇-水，结果发现，乙腈-水系统梯度洗脱效果好。红景天的主要有效成分红景天苷和没食子酸均为酚类化合物，显酸性，故在流动相中加入一定量的酸以抑制酚羟基离子化，分离效果明显提高。在酸种类的选择上，比较了甲酸、磷酸和冰醋酸溶液，分离效果为甲酸>磷酸>冰醋酸；但是甲酸为有机酸，酸性明显强于磷酸，使用时间长容易腐蚀色谱柱，故选择流动相为乙腈-磷酸水溶液。同时也考察了在超纯水中加入不同体积分数（0.05%、0.10%、0.20%）的磷酸、不同柱温（30、35、40 ℃）及不同流速（0.3、0.4、0.5 mL·min-1）。结果表明，流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液、流速为0.4 mL·min-1，柱温为30 ℃时对红景天药材进行梯度洗脱，基线平稳，各化合物之间分离度高且峰形较好，方法简单，便于操作和控制成本。同时采用PDA 检测器考察所需物质紫外吸收，没食子酸最大吸收波长在270 nm，红景天苷最大吸收波长在275 nm，考虑各峰在275 nm 有较强的吸收，并参考《中国药典》2020年版，选择275 nm为检测波长。

3.2 特征图谱

7批红景天正品UPLC 图谱与红景天正品的共有模式特征图谱之间相似度>0.8，相似度良好，说明不同批次正品红景天成分组成类似。而其他20 批红景天习用品、代用品与正品共有模式特征图谱之间相似度均大于0.7，说明红景天正品与习用品、代用品成分之间存在一定的差异。

3.3 聚类分析

聚类分析结果表明，不同品种的红景天之间存在差异，不同品种的样品能够显著分开。唐古红景天与狭叶红景天距离较近，说明两者化学成分组成相似。而长鞭红景天与其他3 种红景天距离较远，说明长鞭红景天的化学成分组成与其他3 种红景天差异较大。

3.4 PCA

PCA 结果表明，不同品种之间成分存在一定的差异性，每个品种有特定的特征峰；长鞭红景天成分相比其他品种差异性最大。

3.5 结论

本实验收集了不同品种、不同产地的药用红景天样品，在同一色谱条件下建立药材的特征图谱，并用化学计量分析法对大花红景天（正品）、唐古红景天和狭叶红景天（习用品）及长鞭红景天（代用品）的数据进行聚类分析和PCA，研究了不同红景天的特有成分和共有成分，结果表明，不同批次的大花红景天特征图谱相似度高，红景天习用品、代用品特征图谱相似度较低，成分有一定差异。本实验建立的UPLC 特征图谱方法专属性强、准确性高；聚类分析可区分4 种红景天药材；PCA 较好地展示了不同品种成分的差异性，为红景天药材及其饮片或中成药投料的鉴定、质量评价提供了参考。