基于SSR标记对65份大白菜自交系的聚类分析

孟 艳，卢倩倩，刘小愿，王亚秀，张学芬，和禹廷，张妮南，高京草，张鲁刚

(西北农林科技大学 园艺学院，陕西杨凌 712100)

大白菜属于十字花科芸薹属蔬菜，异花授粉，天然杂交率高，是杂种优势比较明显的作物。大白菜在中国栽培历史悠久，适应性强，全国各地广泛种植，由于大白菜栽培地域性强、各地消费习惯不同，因此各地不同的育种团队根据不同的育种方向培育了各具特色的大白菜种质资源。对大白菜自交系进行多样性分析和类群划分，在合理选配亲本，构建大白菜杂种优势群，及预测杂种优势有着重要意义。

近年来分子标记技术的快速发展为自交系类群的划分提供了新的分子方法，使划分结果更准确。国内外学者利用RFLP、RAPD、SSR、AFLP等分子标记分别对亲缘关系明确的玉米材料进行杂种优势群划分[1]，所得结果与系谱资料基本吻合，在油菜、辣椒、番茄、花椰菜类、白菜等研究中均证明结果具有真实可靠性[2-8]。SSR标记是建立在PCR反应基础之上的一种遗传标记，以多态性丰富、共显性遗传、重复性高、稳定可靠、操作简单等优点被广泛应用于种质的遗传多样性研究。利用SSR分子标记技术聚类分析基于分子水平的差异，不受环境影响，结果稳定合理。本研究利用SSR分子标记对西北农林科技大学大白菜课题组选育的65份自交系材料进行多样性和类群划分，为进一步亲本选配、大白菜杂种优势利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用65份自交系材料来源于西北农林科技大学园艺学院十字花科大白菜育种课题组(表1)，所有自交系均连续多代自交，性状稳定。用由西北农林科技大学园艺学院大白菜课题组保存的多态性良好，平均分布在10条染色体的26对SSR引物对自交系进行扩增分析。引物详细信息见隋光磊等[9]，由上海生物工程有限公司 合成。

表1 供试大白菜自交系

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA提取和SSR多态性鉴定 每个自交系各选取5个单株，选取健康自交系的嫩叶0.5 g，用改良的CTAB法[10]提取基因组DNA，用1 g/L琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，微量紫外分光光度计检测DNA质量与浓度(NanoDrop2000c)，稀释至100 ng/μL，保存于4 ℃，用于PCR扩增。

PCR扩增反应体系体积为10 μL体系。扩增好的PCR产物4 ℃保存，利用12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电压 200 V，电流 100 mA，时间 1.5 h。电泳结束之后，使用简易银染法显色观察[11]。

1.2.2 数据分析统计 SSR标记根据电泳图谱在相同迁移位置上有带者记为1，无带者记为0，建立0-1数据库。POPGENE1.32统计观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)，计算Nei基因多样性指数(H)及Shannon多样性信息指数(H＇)。利用NTSYS2.1软件中的SHAN程序中的非加权平均法(UPGMA)对65自交系材料进行聚类分析。用SPSS 20.0对表型性状进行聚类分析及一致性分析[12]。

2 结果与分析

2.1 SSR标记多样性分析

26对引物对65份自交系材料进行扩增，共扩增出85条带，每对引物扩出2～5条带，多态性位点条带处在100～400 bp之间。通过POPGENE 1.32软件分析，得到表2结果。65份自交系材料的平均观测等位基因数为3.192 3，平均有效等位基因数为2.299 1，有效等位基因比例为72.02%。统计分析表明，平均Nei基因多样性指数为0.541 5，平均Shannon多态性指数为 0.913 5，都反映出供试材料较高的遗传多样性。

表2 大白菜自交系SSR标记多样性分析

2.2 SSR分子标记聚类结果分析

根据SSR标记聚类结果如图1，在相似系数0.5处，65份自交系共聚成5大类群：第Ⅰ类包括35份材料，包括19份不育系、9份保持系及7份橙色材料，其中保持系06J30、15S1094及不育系18BC2、18BC5、18BC6、18BC9、18BC11为橙色材料，这类橙色材料表型以叠抱、头球形和筒形为主，其余材料包括两份紫心材料14S838及18BC36，表型为叠抱筒形，19份白色材料表型为叠抱和舒心，头球和筒形；类群Ⅰ在0.52处可划分为2个亚群，亚群Ⅰ包括28份材料：8份保持系及20份不育系材料、亚群Ⅱ包括7份橙色材料；第Ⅱ类包括9份炮弹形材料，18S460、18S469为高桩舒心晚熟材料，其余7份为中矮桩合抱材料；第Ⅲ类仅有18S121、18S501表型表现为中高桩、黄心长炮弹形材料；第Ⅳ类群包括11份材料，其中包括5份橙色叠抱头球形近筒形材料和6份黄心舒心筒形或头球形材料；第Ⅴ类包括8份材料，除18S421为黄心炮弹形，其余7份为橙色、球形及头球形材料。

65份材料中包括26份橙色材料，分布在类群Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ，材料类型比较丰富，球形有球形、头球形、筒形，抱合类型有叠抱、合抱，以及5份橙色不育材料和2份橙色保持系。

2.3 SSR标记聚类与表型性状聚类一致性分析

为了了解大白菜种质资源SSR标记与表型性状间相关性，将其中37份大白菜自交系的SSR标记和23个表型性状分别进行聚类(图2)，聚类表型性状包括：雄蕊育性、株型、茸毛密度、叶球颜色、结球形状、球内颜色、中肋颜色、中心柱形状、抱合类型、顶部形状、毛重、净重、株高、株幅、外叶数、外叶长、外叶宽、中肋长、中肋宽、球高、球宽、球内叶数、中心柱长。结果发现表型聚类和SSR标记聚类均将37份材料划分为2大类群，表型性状聚类在相似距离7处进一步划分4个亚群，SSR标记在0.49处同样划分为4个亚群。两种聚类方法划分的类群Ⅰ、类群Ⅳ组分基本相同且保持系15S1094和不育系18BC5、18BC6均聚类在类群Ⅲ。17S62、17S64、17S81、17S104、17S430、17S623、17S775、17S781、17S810、17S958、17S967这11个橙色材料在两种聚类方法中均集中在类群Ⅱ、Ⅲ，但是组分分布差异较大，在查询系谱来源发现17S62和17S64来源相同，17S104和17S958来源相同，17S430、17S623、17S810来源相同，对比发现SSR标记可以准确地将系谱来源相同的材料聚类在一起。利用Kappa检验两种聚类方法的一致性为0.459,表明两种聚类结果一致性为中度。

3 讨 论

3.1 橙色大白菜遗传分析

球色研究一直是育种家们关注的热点，现已有白色、浅黄、橙色、紫色等大白菜[13]，本研究中使用的自交系材料包括橙色、紫色、白色和浅黄大白菜，利用SSR标记聚类发现橙色材料主要被划分为三个类群，分别为橙色筒形为主、橙色头球形为主和橙色头球近筒形为主。对橙色大白菜进一步分析发现，橙色大白菜主要为筒形材料，头球形和球形次之，缺乏橙色炮弹形材料，抱合类型仅有叠抱和合抱两种类型，花色以橙色和黄色花为主，株型以半直立为主，平展材料次之，叶色为绿色和浅绿色。表明橙色大白菜自交系种质资源比较丰富，对今后橙色大白菜选育有一定指导意义。

3.2 基于SSR标记分析大白菜多样性

我国大白菜种质资源丰富，遗传背景复杂，育种学家们一直加强杂种优势群划分及杂优模式研究，管晓雨[14]、刘何[15]、原静云等[16]均进行了大白菜种质资源遗传多样性及优势群划分研究。SSR标记是常用于遗传多样分析方法之一，具有多态性好、操作简便的特点。SSR标记方法在玉米[17]、水稻[18]等作物中已被证明可以准确的将不知系谱来源的自交系准确的划分到相应的种质类群，普遍用于辣椒[4]、番茄[5]、白菜[19-20]等作物的自交系类群划分，目前已是大白菜种质资源研究中利用最广泛分子标记之一。本研究采用26对多态性良好的引物对65份大白菜自交系进行遗传背景和亲缘关系分析，将65份大白菜自交系划分为5个类群，通过查阅部分材料的系谱，发现基于SSR标记聚类可以将系谱来源相同的材料划分在同一类群，表明SSR标记可以真实的反映出65份大白菜自交系间亲缘关系的远近。

基于表型性状分析是传统的划分自交系材料类群的方法，表型性状统计成本低，但其容易受环境影响导致类群划分不准确。Hem等[21]在番茄上研究了表型性状和分子标记对植物种质类群划分在提高杂交组合选配的效率高低，最终发现基于分子标记的杂交具有更高的效率，本研究中也证实了这一点。Zhang等[22]在食用粳稻风味研究中发现风味主要是遗传决定，但其农艺性状可能和地理起源相关密切，农艺性状受遗传和环境共同决定，表明利用农艺性状进行多样性分析可以作为分子标记的补充证明。

本研究中的65份大白菜自交系球形有球形、头球形、筒形、长筒形和炮弹形，球内颜色有橙色、紫色、黄色、白色，抱合类型有合抱、叠抱、舒心，表明大白菜自交系多样性比较丰富，具有培育出各种形状、不同大小的大白菜的潜力。利用表型性状聚类划分自交系类群和利用SSR标记划分类群一致性为中度，表明两种方法提供的遗传信息有所不同，这与郭守鹏等[23]在茄子中的研究结果一致。这为选配新的优势杂交种提供理论依据的同时，也提醒表型性状和分子标记提供的信息有所不同，在育种实践中要兼顾二者。