UPLC 法测定大黄虫丸中5 种蒽醌类活性成分的含量

卓 辉，蓝梦柳，张海凤，钟玉环，许 文，吴水生

（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

1 仪器与材料

1.1 仪器 ACQUITY UPLC H-CLASS 超高效液相色谱仪（美国Water 公司）；GT-2120 QTS 智能超声清洗仪（广东固特超声股份有限公司）；DV215CD十万分之一天平（美国OHAUS 公司）；ME204E 分析天平（瑞士METTLER 公司）。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液制备 取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品适量，精密称定，用甲醇溶解制得质量浓度依次为11.2、14.4、16.0、30.4、12.0 μg／mL 的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液制备 参照2020 年版《中华人民共和国药典（一部）》［2］大黄虫丸供试品溶液制备法：取剪碎的大黄虫丸1 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，浸泡12 h 后用玻棒研磨使样品溶散，用数滴甲醇冲洗玻棒于锥形瓶中，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足损失的重量，或挥散至原重量，摇匀，滤过，取续滤液。

2.4 检测波长的选择 全波长扫描检测显示：芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的最大吸收波长分别为224.7、230.6、222.3、224.7、222.3 nm，但在各个最大吸收波长下，色谱图均有不同程度的基线漂移。在254 nm 波长下，以上5 种蒽醌类活性成分的色谱图基线平稳，峰形对称，故选择254 nm为检测波长。

2.5 色谱条件的优化 考察了Syncronis aQ 柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18 柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）和Uitimate UHPLC AQ-C18 柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）3 种色谱柱对上述5 种成分的分离效果，其中Syncronis aQ 柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）能较好地分离芦荟大黄素与大黄酸，且各成分峰形对称；以甲醇-0.1%甲酸水（85∶15）为流动相时，5 种成分可得到较好分离，但连续进样后各成分保留时间发生漂移，且靠后的色谱峰峰宽变大，优化为“2.6”项下梯度洗脱条件后，各成分的保留时间未见飘移，且峰宽一致，峰形尖锐。故选择Syncronis aQ 柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱与甲醇-0.1%甲酸水梯度洗脱的色谱条件。

2.6 色谱条件色谱柱 Syncronis aQ 柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脱（0～2 min，85%A；2～3 min，85%A→90%A；3～8 min，90%A；8～10 min，90%→85%A）；流速：0.20 mL／min；柱温：30 ℃；进样量：2 μL；检测波长：254 nm。

2.7 方法学考察

2.7.1 系统适应性考察 取“2.1”项下混合对照品溶液，按“2.6”项下色谱条件操作，使用Empower 3系统分析芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚在254 nm 检测波长下与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数均大于8 000。

2.7.2 线性关系考察 取“2.1”项下混合对照品溶液，逐级加甲醇稀释2、4、8、16、32、64 倍，连同母液共7个浓度，按“2.6”项下色谱条件依次进样，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。将混合对照品逐步稀释，分别以信噪比等于3 时的样品浓度为检测限，以信噪比等于10 时的样品浓度为定量限。 5 种蒽醌类活性成分的回归方程、相关系数（r）、线性范围、检测限与定量限结果见表1。 表1 表明各成分在其各自质量浓度范围内呈良好的线性关系。

表1 5 种蒽醌类成分的保留时间、回归方程、线性范围、检测限及定量限

2.7.3 专属性考察 取混合对照品溶液、供试品溶液以及阴性样品溶液，按“2.6”项下色谱条件进样检测，结果见图1。 混合对照品溶液及供试品溶液中5 种待测成分色谱峰分离度较好，阴性样品溶液在相应位置未见色谱峰。

图1 混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液的UPLC 图

2.7.4 精密度实验 取“2.1”项下混合对照品溶液适量，按照“2.6”项下色谱条件连续进样6 次，记录色谱图，以峰面积计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚色谱峰面积的RSD 分别为1.2%、2.2%、1.4%、0.4%、0.5%，表明仪器的精密度良好。

2.7.5 稳定性实验 取同一供试品溶液，按照“2.6”项下色谱条件，分别于0、1、2、4、8、12、24 h 进样2 μL，记录色谱图，以峰面积计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚色谱峰面积的RSD 分别为1.8%、1.9%、2.0%、1.9%、1.7%、2.5%、2.1%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.7.7 加样回收率实验 取“2.7.6”项下已知含量的大黄虫丸1.0 g，精密称定，分别加入相当于样品中已知5 种蒽醌类化合物质量100%的对照品，按“2.2”项平行制备6 份供试品溶液，按“2.6”项下色谱条件进样，分别计算5 种蒽醌类成分的加样回收率，结果见表2。 表2 表明方法准确性较好。

表2 5 种蒽醌类活性成分的加样回收率实验结果

表3 不同厂家大黄虫丸中5 种蒽醌类活性成分的含量测定结果mg／g

表3 不同厂家大黄虫丸中5 种蒽醌类活性成分的含量测定结果mg／g

厂家北京同仁堂股份有限公司广东恒诚制药股份有限公司江苏颐海药业有限责任公司生产批号20010357 20010140 20010353 20201007 20210201 20201008 210302 210301 210303芦荟大黄素0.295 0.263 0.253 0.496 0.450 0.485 0.332 0.357 0.348大黄酸0.805 0.733 0.698 0.184 0.158 0.263 0.496 0.568 0.517大黄素0.448 0.423 0.407 0.205 0.200 0.196 0.389 0.436 0.412大黄酚0.859 0.812 0.784 1.577 1.805 1.539 0.911 0.981 0.959大黄素甲醚0.231 0.219 0.211 0.341 0.386 0.333 0.192 0.206 0.203

表4 不同厂家大黄虫丸中5 种蒽醌类活性成分的平均总含量与各成分占比

表4 不同厂家大黄虫丸中5 种蒽醌类活性成分的平均总含量与各成分占比

厂家北京同仁堂股份有限公司广东恒诚制药股份有限公司江苏颐海药业有限责任公司平均总含量／（mg／g）2.480 2.873 2.436芦荟大黄素／%10.9 16.6 14.2大黄酸／%30.0 7.1 21.6大黄素／%17.2 7.0 16.9大黄酚／%33.0 57.0 39.0大黄素甲醚／%8.9 12.3 8.2

3 讨 论