石杉碱甲二元醇质体温敏凝胶体外释放度及鼻腔纤毛毒性的实验研究

陈筱瑜，冯连晶，黄庆德*，冯玉天娇

（1.福建卫生职业技术学院药学院，福建 福州 350101；2.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

石杉碱甲（Huperzine A，Hup A）是从民间草药蛇足石衫（Huperzia serrata）中分离得到的一种石松类生物碱，对治疗阿尔茨海默症（Alzheimer disease，AD）有比较显著的疗效［1-3］。鼻腔给药是目前比较理想的脑靶向黏膜给药途径，其给药吸收快，生物利用度高，可以避免首过效应且使用方便［4］。 课题组将Hup A 制成鼻用二元醇质体温敏凝胶，既保留了醇质体良好的透膜性，又利用温敏凝胶随外界温度变化而发生相转变，由液态转化为非化学交联半固体凝胶的特性［5-8］，提高制剂在鼻腔中滞留时间，减少药物流失， 增加药物吸收并靶向脑组织， 减小Hup A 片剂、胶囊剂和注射剂等剂型因缺乏脑选择性而产生的外周胆碱能系统毒性。 但鼻腔给药可能对鼻腔的纤毛产生不同程度的影响，某些药物或辅料会引起鼻黏膜一系列生理结构和功能的改变，使鼻腔不能发挥正常的生理屏障功能［9］。 本研究采用无膜溶出法和Franz 扩散池法对Hup A 二元醇质体温敏凝胶的体外释放度进行初步考察，以探索药物体外释药的机制，同时选用在体蟾蜍上颚模型法对Hup A 二元醇质体温敏凝胶的鼻腔纤毛毒性进行了研究，初步评价其鼻腔用药的安全性，为相关制剂研发提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-2030 高效液相色谱仪、LC-2030 UV检测器（日本岛津公司）；YU-1901 双光束紫外分光

光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；MPLR-702 恒温磁力搅拌器（常州市金坛大地自动化仪器厂）；STARTER3100 PH 酸度仪（美国OHAUS 公司）；FA2004N 万分之一电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；XS205 十万分之一电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；Franz 扩散池；DKZ 系列电热恒温振荡水槽（上海一恒科技有限公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；HH-2 数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；MD34 透析袋（北京索莱宝科技有限公司）；玻璃液体温度计；E100 生物显微镜（日本Nikon Eclipss 公司）。

1.2 试药 Hup A 对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：H29D8J51963，纯度≥98%）；Hup A 原料药（西安普莱特生物工程有限公司，批号：HA2019 1102，纯度：99%）；Hup A 二元醇质体温敏凝胶（实验室自制）；呋麻滴鼻液（含1%盐酸麻黄碱，上海运佳黄浦制药，批号：191104）；去氧胆酸钠（美仑生物有限公司，批号：S0802A）；生理盐水（江西科伦药业有限公司，批号：C20030204B）；氢氧化钠（国药集团化学试剂有限公司，批号：20180131）；磷酸二氢钾（上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10419856）；水为超纯水；甲醇、乙腈均为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

1.3 动物 中华大蟾蜍，普通级，体质量40～50 g，雌雄兼有，购自湖北省枣阳伟华蟾业有限公司。

2 方法与结果

2.1 Hup A 含量测定方法的建立

2.1.1 色谱条件 色谱柱：DiamonsilC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.02 mol／mL 磷酸盐缓冲溶液（pH 值2.5）∶乙腈（88∶12）；检测波长：311 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL／min；进样量：10 μL。

2.1.2 溶液制备

2.1.2.1 人工鼻液的制备 精密称取磷酸二氢钾13.6 g，加去离子水溶解，定容至1 000 mL 量瓶中，用0.1 mol／L 氢氧化钠溶液调至pH＝6.8，即得。

2.1.2.2 对照品母液的制备 精密称取Hup A 对照品适量，置于25 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，0.45 μm 微孔滤膜滤过，制得84.4 μg／mL Hup A 对照品母液，备用。

2.1.2.3 供试品溶液的制备 精密称取Hup A 二元醇质体温敏凝胶0.5 g，置于5 mL 量瓶中，用人工鼻液超声溶解，定容至刻度，0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.1.2.4 阴性对照溶液的制备 精密称取空白二元醇质体温敏凝胶0.5 g，置于5 mL 量瓶中，用人工鼻液超声溶解，定容至刻度，0.45 μm 微孔滤膜滤过，得阴性对照溶液。

2.1.3 专属性试验 将供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液，按照“2.1.1”项下的色谱条件进样，分别注入高效液相色谱仪进行检测，结果见图1。 由测定结果可知：在该色谱条件下，制备二元醇质体温敏凝胶的各辅料对Hup A 的含量测定无干扰，专属性好。

图1 Hup A 高效液相色谱图

2.1.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.1.2.2”项下的对照品母液0.1、0.5、1.0、2.0、2.5 mL，将其定容于5 mL 的量瓶中，得1.688、8.44、16.88、33.76、42.2 μg／mL Hup A 对照品溶液，0.45 μm 微孔滤膜滤过，照上述色谱条件测定。以质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：Y＝1.686 2×104X－9.401 2×103，r＝0.999 0。结果表明：Hup A 在1.688～42.2 μg／mL 范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.5 精密度试验 精密量取1 mL 对照品母液，置10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，0.45 μm 滤膜滤过，照“2.1.1”项下色谱条件下重复进样6 次，测定峰面积，计算RSD 值为0.85%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验 取同一批样品6 份，按照“2.1.2.3”项下方法制备供试品溶液，照“2.1.1”项下色谱条件下测定Hup A 的峰面积并求得其含量，计算RSD值，结果显示RSD 值为2.72%，表明本方法重复性良好。

2.1.7 回收率试验 取已知药物浓度的Hup A 二元醇质体温敏凝胶0.5 g 置于25 mL 量瓶中，分别加入Hup A 对照品0.11、0.13、0.15 mg，加入人工鼻液溶解并定容至刻度，0.45 μm 微孔滤膜滤，按照“2.1.1”项下色谱条件测定，计算平均加样回收率和RSD 值。 结果见表1。

表1 回收率测定结果

2.2 体外释放度试验

2.2.1 无膜溶出法考察凝胶体外释放度

2.2.1.1 凝胶溶蚀行为考察 取10 mL 塑料离心管，称重为W0，向离心管中缓慢加入约1 g Hup A 二元醇质体温敏凝胶，于35 ℃恒温水浴中预热30 min，使其完全形成凝胶，称重为W1。 缓慢加入35 ℃已超声脱气人工鼻液2 mL，置35 ℃恒温振荡器中，振荡频率为200 r／min，每隔30 min 倒出上层液体，立即擦干离心管上的水珠，称离心管重为W2。 缓慢补加同温度人工鼻液2 mL，放入恒温振荡器中继续上述操作，直至离心管内溶液全部倒出。 计算各时间点凝胶累积溶蚀率Q，以时间（t）为横坐标（X），累积溶蚀率（Q）为纵坐标（Y），绘制溶蚀曲线。 结果见图2。 凝胶溶蚀曲线经动力学方程拟合后得到方程：Y＝0.551 6X－2.202 7，r＝0.996 1。 凝胶溶蚀以恒定的速率进行，与时间呈现良好的线性关系。

图2 Hup A 二元醇质体温敏凝胶溶蚀曲线

Q＝（W1－W2）／（W1－W0）×100%

2.2.1.2 体外释放度考察 将“2.2.1.1”项下各时间点取出的人工鼻液，置10 mL 量瓶中，用甲醇定容，照“2.1.1”项下的色谱条件测定人工鼻液中的药物含量，并计算各时间点药物累积释放率Qn，以累积释放率（Qn）为纵坐标，时间（t）为横坐标，绘制体外释放曲线，结果见图3。 释药曲线经动力学方程拟合后得到方程：Y＝0.556 7X－0.363 6，r＝0.999 0。由图3 可知：药物释放曲线与时间呈现良好线性关系，显示出零级动力学特征。

图3 无膜溶出法Hup A 二元醇质体温敏凝胶体外释放曲线

2.2.1.3 f2相似因子分析药物释放与凝胶溶蚀行为的相关性 相似因子（f2）常用于评价溶出曲线相似性，具体公式如下：

注：Ti 为i 时间受检样品的释药量；Ri 为i 时间参比样品的释药量；n 为取样点个数。

本实验引用f2相似因子评价Hup A 二元醇质体温敏凝胶体外释放曲线和体外溶蚀曲线的相似性，f2值为73.07，说明Hup A 二元醇质体温敏凝胶体外溶蚀和体外药物释放同歩。

2.2.2 Franz 扩散池法考察凝胶体外释放度 将活化后的透析袋（截留相对分子量6 000～8 000 U）剪成半透膜固定于供给池与接收池之间，精密称取1 g Hup A 二元醇质体温敏凝胶加入扩散池给药池中，使其均匀分布于半透膜表面，于35 ℃水浴下放置30 min，使温敏凝胶充分胶凝。 接收池中加入7 mL人工鼻液，扩散池温度保持（35±0.5）℃，磁力搅拌的速度为200 r／min。分别于0.25、0.5、0.75、1、2、4、8、12、24、48 h 取样1 mL， 同时补充等温的人工鼻液1 mL。 将取得的样品溶液经0.45 μm 微孔滤膜滤过，用HPLC 测定样品中药物含量，计算二元醇质体温敏凝胶中Hup A 的累积释放率（Qn）。累积释放率（Qn）的计算公式如下。 以 时间（t）为横坐 标（X），累积释放率（Qn）为纵坐标（Y），绘制释放曲线，结果见图4。 结果表明：Hup A 释药缓慢，前12 h的累积释放率仅能达到53%，随后可持续稳定释药，释放时间可达到48 h 以上。

图4 Franz 扩散池法测定Hup A 二元醇质体温敏凝胶体外释放曲线

注：Q0为Hup A 总的药物含量；V0为释放介质总体积（7 mL）；V 为每次取样时的体积（1 mL）；Cn为不同取样点接受液的浓度；Ci为各取样点取样液浓度（μg／mL）；i、n 为取样次数。

2.2.3 体外释药行为分析 以零级动力学方程、一级动力学方程和Higuchi 动力学方程对无膜溶出法、Franz 扩散池法测得的温敏凝胶中Hup A 的体外释放曲线进行拟合分析，以探讨其释药行为，结果见表2。 采用无膜溶出法时，Hup A 二元醇质体温敏凝胶体外释放曲线符合零级动力学方程（r＝0.999 7），说明其药物的释放主要受凝胶溶蚀控制，基质溶蚀对药物释放起决定性作用；采用Franz 扩散池法时，Hup A 二元醇质体温敏凝胶体外释放曲线符合Higuchi 动力学方程（r＝0.991 6），说明其释药机制为药物扩散和骨架溶蚀的协同作用［10］。由图3、图4 可知：采用无膜溶出法测得的药物释放速率显著高于Franz 扩散池法。 采用无膜溶出法时，3 h药物释放率达到100%；采用Franz 扩散池法时，Hup A 释药缓慢，前12 h 其累积释放率仅能达到53%，随后可持续稳定释药，释放时间可持续48 h 以上。说明鼻腔给药时，药物的释放受鼻液对温敏凝胶基质溶蚀及药物从温敏凝胶基质中向外扩散两个因素的影响。

表2 Hup A 二元醇质体温敏凝胶体外释放曲线拟合结果

2.3 鼻纤毛毒性试验

2.3.1 鼻纤毛毒性试验 将20 只健康蟾蜍按体质量分成4 组，每组5 只，即呋麻滴鼻液组（含1%盐酸麻黄碱）、1%去氧胆酸钠组、生理盐水组、Hup A二元醇质体温敏凝胶组。

将蟾蜍用探针破坏脊髓后，仰卧固定于蛙板上，用止血钳将其口腔撑开并固定。 各组分别于口腔黏膜表面滴加0.5 mL 呋麻滴鼻液、1%去氧胆酸钠溶液、生理盐水以及Hup A 二元醇质体温敏凝胶，使其完全浸没上颚；30 min 后分离上腭黏膜，用生理盐水冲洗干净，剪取适当黏膜平铺于载玻片上，盖上盖玻片，于40×100 倍生物数码显微镜下观察纤毛运动情况；随后将载玻片置于生理盐水饱和的层析缸中，每隔30 min 取出观察纤毛运动情况，直至纤毛停止摆动为止。 记录纤毛持续运动时间（PVD），计算纤毛持续运动时间百分率（PPV），PPV＝PVD药物组／PVD生理盐水组×100%，并用IBM SPSS Statistics 21 软件对数据进行检验，结果见表3。 结果表明：Hup A以及各种辅料对纤毛运动影响很小，无明显纤毛毒性，可用于鼻腔给药。

表3 4 组PVD 与PPV 比较结果（±s）

表3 4 组PVD 与PPV 比较结果（±s）

注：与1%去氧胆酸钠组比较，1） P＜0.01。

n5555 PVD／min 639±171）630±111）40±4 603±51）组别生理盐水组呋麻滴鼻液组1%去氧胆酸钠组Hup A 二元醇质体温敏凝胶组PPV／%100.01）98.61）6.3 94.41）

2.3.2 鼻纤毛形态 采用具有拍照功能的生物数码显微镜观察各组蟾蜍上颚纤毛的运动形态。 由图5 可知：1%去氧胆酸钠组的纤毛边缘基本脱落，黏膜受损，对纤毛运动有不可逆的抑制作用；生理盐水组、呋麻滴鼻液组、Hup A 二元醇质体温敏凝胶组的纤毛清晰完整，排列整齐，而且有一定规律和频率的向同一方向摆动。以上结果说明Hup A 以及各种辅料对纤毛形态影响很小，无明显纤毛毒性，可用于鼻腔给药。

图5 显微镜下蟾蜍上颚黏膜纤毛组织形态（×200）

3 讨 论

3.1 体外释放模型的选择 对于温敏凝胶的体外释放研究尚没有统一的标准和方法，主要基于2 种模型，即无膜溶出和有膜溶出模型［11］。 为探讨Hup A 二元醇质体温敏凝胶的体外释药机制，本实验采用无膜溶出法和有膜的Franz 扩散池法进行体外释放度研究。采用Franz 扩散池法时，凝胶通过半透膜与少量的释放介质接触，凝胶基质的溶蚀较慢，药物需从凝胶中扩散至少量的释放介质后，再通过半透膜扩散至大量释放介质中。 由于半透膜两侧的药物浓度梯度较小，使得释药速率偏慢，药物的释放主要为药物扩散和骨架溶蚀的协同作用，这与释放曲线拟合符合Higuchi 方程的结果是一致的。 采用无膜溶出法时，凝胶直接浸没在释放介质中，药物则随着凝胶溶蚀而释放。通过f2相似因子对药物释放与凝胶溶蚀行为的相关性分析， f2值越大，表明两种制剂的体外释药曲线差异越小。 若50≤f2≤100，表示两制剂的溶出曲线相似，即受试制剂与参比制剂释药无差别［12］。Hup A 二元醇质体温敏凝胶体外释放曲线和体外溶蚀曲线的f2＝73.07，说明药物的释放主要受凝胶基质溶蚀的影响，这与Hup A体外释放曲线拟合符合零级释药模型的结果是一致的。 鼻腔给药时，药物从凝胶基质中释放要受鼻液对温敏凝胶溶蚀的影响，Hup A 二元醇质体温敏凝胶药物的释放机制应为药物扩散与凝胶基质溶蚀的协同作用。

3.2 鼻腔纤毛毒性方法的选择 鼻腔给药时，由于鼻腔制剂中药物与辅料的影响，鼻纤毛运动常会受到不同程度的损害，甚至可使纤毛运动发生不可逆的停止，影响鼻纤毛的清除功能，故对鼻纤毛毒性的影响是鼻腔制剂的重要研究内容之一。 考察鼻纤毛持续运动时间的方法有在体法和离体法。 由于混悬颗粒或凝胶剂容易粘附在离体黏膜的表面和背面，很难用生理盐水清洗干净，同时残留颗粒的存在和剧烈淋洗本身对纤毛运动就会产生较大影响，离体法难以正确评价混悬型或者黏稠性药物制剂的纤毛毒性，因此离体法不适宜评价本制剂对鼻腔纤毛毒性的影响。 在体法是将药物在蟾蜍上作用一段时间，用生理盐水洗净后分离黏膜，观察纤毛运动情况。 在体法的优点是更接近药物在鼻腔的实际作用情况，尤其适用于混悬剂、凝胶剂等难以淋洗干净的剂型，因此，本实验采用在体蟾蜍上颚模型法评价温敏凝胶对鼻腔纤毛的毒性，以生理盐水及市售呋麻滴鼻液作阴性对照，对鼻纤毛有明显毒性的去氧胆酸钠作阳性对照。 结果表明：Hup A 二元醇质体温敏凝胶给药后鼻纤毛持续运动时间与生理盐水组和呋麻滴鼻液组比较无显著性差异（P＞0.05），与1%去氧胆酸钠组比较有非常显著性差异（P＜0.01），说明其对蟾蜍上颚黏膜纤毛运动影响不大，制剂的纤毛毒性较小，可以用于鼻腔给药。