慢性丙型肝炎患者血清和外泌体LncRNA HEIH水平及其临床意义探讨*

贾 坤，苏建荣，孙 伟

慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)是感染丙型肝炎病毒(HCV)所致的传染病。HCV为小RNA病毒，侵犯肝脏后会引起一系列免疫反应，导致慢性肝炎。如不给予治疗，可能会发展为肝硬化，严重时可诱发肝细胞癌((hepatocellular carcinoma，HCC)[1]。当HCV感染细胞后，已感染病毒的细胞会分泌包裹病毒RNA的外泌体，以复合物的形式传播至未感染细胞，并参与未感染细胞生物功能的调控，影响其正常的生理功能[2，3]。目前认为，从分子生物学角度研究CHC的发病机制或有助于后期进行靶向治疗，以改善患者预后。长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一类参与了多种生物学进程的非编码RNA，包含多种类型的转录本。肝细胞癌中高表达的中长链非编码RNA(long non-coding RNA in high expression in HCC，LncRNA-HEIH)能够影响细胞周期，但其在CHC患者的变化研究尚处于探索阶段。本研究分析了CHC患者血清和外泌体LncRNA HEIH水平变化，旨在探究其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2017年9月～2020年7月我院诊治的CHC患者77例，男45例，女32例；年龄为45～71岁，平均年龄为(59.5±5.7)岁。符合《丙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[4]的诊断标准。排除合并其他类型肝脏疾病、严重的糖尿病和感染性疾病、妊娠或哺乳期妇女、严重的心血管疾病和恶性肿瘤患者。另选择同期我院诊治的HCC患者40例，男24例，女16例；年龄43～69岁，平均年龄为(58.7±6.1)岁。符合《原发性肝癌规范化病理诊断指南(2015年版)》[5,6]的诊断标准。患者签署知情同意书，本研究经我院医学伦理学委员会审核。

1.2 治疗方法 给予所有CHC患者标准化，即聚乙二醇化干扰素-α联合利巴韦林治疗6个月。

1.3 血清LncRNA HEIH水平检测 采集空腹静脉血3 ml 2份，置于EDTA管中保存，在室温下静置30 min，取其中一份，3000 r/m离心10 min，留取上清液，放置于-80℃下保存备检。定量RT-PCR反应：应用上海生工生物工程股份有限公司合成的PCR引物，基因序列如下，GAPHD-F：5′-CATCTTCTTTTGCGTCGCCA-3′；GAPHD-R：5′-TTAAAAGCAGCCCTGGTGACC-3′；LncRNA HEIH-F：5′-AAGAACTCTTCGCTCCAGCC-3′；LncRNA HEIH-R：5′-ACAAAAGCAGACTAGGGCGG-3′。取血清，溶于Reagent Kit液中，加入氯仿，用裂解液分解为水相和有机相，提取含有RNA的上层水相(试剂盒由日本SYBR提供)，加入乙醇，反应条件为16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，用双蒸水作为对照。PCR反应条件为95℃ 10 min、95℃ 10 s、60℃ 30 s，共45个循环，采用2-△△法进行计算。

1.4 外泌体LncRNA HEIH水平检测 提取外泌体，取血清，在4℃下超速离心2 h，加入1×PBS溶液1 ml洗涤沉淀物。然后，再次离心3 h，收集沉淀，置于-80℃下保存备检。外泌体RNA提取：用PBS重悬沉淀物，取悬液20 μL，滴加于载样铜网上，用滤纸从滤网侧边吸干液体，用3%磷钨酸溶液负染5 min，室温晾干，在透射电镜(COXEM-30 PLUS，韩国)下观察外泌体形态。然后，应用miRNeasy Mini kit试剂盒提取外泌体总RNA。实时定量RT-PCR反应同上。

1.5 肝活检 在彩色多普勒超声诊断仪下定位，使用16 G穿刺针穿刺，取得肝组织，置于甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片，常规HE染色，进行肝组织炎症分级和肝纤维化分期诊断。

2 结果

2.1 两组血清和外泌体LncRNA HEIH水平比较 CHC患者血清和外泌体LncRNA HEIH水显著低于HCC患者(P<0.05，表1)。

表1 两组血清和外泌体LncRNA HEIH水平比较

2.2 不同肝组织炎症和纤维化程度的CHC患者血清和外泌体LncRNA HEIH水平比较 肝组织炎症G0～G1患者血清和外泌体LncRNA HEIH水平显著高于肝组织炎症>G2者，肝纤维化S0～S1患者血清和外泌体LncRNA HEIH水平显著高于肝纤维化>S2者(P<0.05，表2)。

表2 不同肝组织病变的CHC患者血清和外泌体LncRNA HEIH水平比较

2.3 血清和外泌体LncRNA HEIH水平与CHC患者肝组织病理学特征的多因素Logistics回归分析 分析发现血清LncRNA HEIH水平<2.0是预测肝组织炎症分级和肝纤维化分期显著的因素(P<0.05，表3)。

表3 血清和外泌体LncRNA HEIH水平预测CHC患者肝组织病理学特征的Logistics回归分析

2.4 应答与不应答组血清和外泌体LncRNA HEIH水平比较 不应答组血清和外泌体LncRNA HEIH水平均显著低于应答组(P<0.05，表4)。

表4 应答与不应答组血清和外泌体LncRNA HEIH水平比较

2.5 血清和外泌体LncRNA HEIH水平预测CHC患者显著肝组织病变的价值分析 血清和外泌体LncRNA HEIH水平预测CHC患者肝组织病变显著的AUC分别为0.764～0.778和0.723～0.736之间(图1,表5)。

图1 血清和外泌体LncRNA HEIH水平预测CHC患者肝组织显著病变的ROC曲线分析

表5 血清和外泌体LncRNA HEIH水平预测肝组织病变价值分析

3 讨论

外泌体是包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡，存在于大多数体液中，其在活体内可作为运载脂质、蛋白质和RNA等物质的新型媒介。相关研究指出，外泌体参与了CHC的发生发展过程[7，8]。HCV感染后在发生坏死性肝组织炎症反应时，会释放含有LncRNA的外泌体[9，10]。故本研究探究了血清和外泌体中LncRNA HEIH水平在CHC患者的临床意义。

LncRNA是一类转录本长度大于200个核苷酸的RNA，具有mRNA许多相同的结构特性，可以在表观遗传学调控、转录调控、转录后调控等多个层面调控基因水平，参与机体生理和病理学过程[11]。相关报道指出，HCC患者血清和外泌体LncRNA HEIH呈现为高水平，且与疾病进展和预后有关[12，13]。本研究发现，CHC患者血清和外泌体LncRNA HEIH水平均低于肝癌患者，肝癌患者LncRNA HEIH高水平可能促进了PGKI分泌，以发挥促进血管生成的作用。本研究发现，CHC患者外泌体LncRNA HEIH水平高于血清水平，其临床意义值得探讨[14，15]。

目前认为，CHC的病情进展与炎症反应有关，减轻机体炎症程度可延缓疾病进展，减缓肝纤维化的发生[16，17]。LncRNA HEIH可诱发肝癌的发生，或与引发肝纤维化有关。本研究发现，肝组织炎症G0～G1患者血清和外泌体LncRNA HEIH水平均显著高于肝组织炎症>G2者，肝纤维化S0～S1患者血清和外泌体LncRNA HEIH水平均显著高于肝纤维化>S2者，说明肝组织炎症分级和肝纤维化分期严重的患者存在血清和外泌体LncRNA HEIH低水平现象，检测它们水平的变化可能有助于判断肝组织病变。本研究进一步分析发现，血清LncRNA HEIH水平是影响肝组织炎症分级和肝纤维化分期的预测因素，但目前尚不知其具体机制。有人认为这或许与LncRNA HEIH与临近的基因相互作用，通过调控染色体构象，改变了基因水平表达[18]。相关研究指出，肝脏可通过产生特异性的外泌体来传递纤维化信号[19]，故我们也认为外泌体LncRNA HEIH水平或与肝纤维化的发生有关。本研究发现对抗病毒治疗不应答组血清和外泌体LncRNA HEIH水平显著低于应答组，可能与这些患者肝组织炎症反应和纤维化程度较严重有关，提示或可通过检测患者血清和外泌体LncRNA HEIH水平来预测其抗病毒治疗的效果。本研究经进一步分析发现，应用血清和外泌体LncRNA HEIH水平预测CHC患者肝组织炎症和纤维化的AUC分别较高，具有一定的临床应用价值。

综上所述，CHC患者存在血清和外泌体LncRNA HEIH水平异常现象，监测它们的变化对判断CHC患者肝组织炎症和纤维化程度或预测抗病毒疗效都有一定的临床应用价值，值得进一步深入研究。