对羟基苯甲酸乙酯和卡松对土壤生态的影响

朱泽业 邵 波

(1.浙江树人大学 生物与环境工程学院 环境工程专业，杭州 310000)

引言

个人护理产品((personal care products，PCPs)是与人们日常生活密切相关的新型污染物，属于PPCPs(药品和个人护理产品)的一类。自1990年代后期以来，美国和欧洲的许多国家一直在研究这些物质的理化性质、去除机制、分析测试和生态毒性。近年来，我国也逐步开展了相关的研究[1]。近几年，PCPs在水和大气等环境介质中被检测到。这些物质主要以尿液和粪便的形式释放到环境中。根据对土壤等环境介质的检测，土壤中PCPs的检测频率也开始逐渐增加，造成“持续性”环境污染现象。PCPs在环境中的残留浓度虽然不高，但分布广泛，成分复杂多样。但长期低剂量接触会对生态环境和人体健康造成不同程度的破坏[2]。因此，开展针对PCPs对土壤的生态影响就极为重要。

对羟基苯甲酸酯类作为常见的食用防腐剂已广泛应用于食品[3]、药品[4]、化妆品及各类儿童制品[5]，主要包括对羟基苯甲酸甲酯(methylparaben，MP)、乙酯(ethylparaben，EP)、丙酯(propylparaben，PP)和丁酯(butylparaben，BP)等。对羟基苯甲酸酯长期以来被认为是一种安全有效的防腐剂和抗菌剂，常用作普遍的食品防腐剂，也用于制药、皮革等其他行业。这些物质在人体内的主要代谢途径是血液和尿液，残留量少，说明它们具有一定的累积作用。但近年来研究发现对羟基苯甲酸酯类污染物对雄果蝇[6]的生殖有一定的毒性以及早孕小鼠着床期子宫内膜功能也存在一定的毒害作用[7]，说明其对人体健康可能造成一定的威胁，但目前对土壤微生物的毒性效应未有相关研究。

异噻唑啉酮类化合物是世界范围内广泛使用的新型杀菌剂，其降解过程和降解产物对生态环境的影响很大。卡松是2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MI)和2-甲基-5-氯-4-异噻唑啉-3-酮(CMI)及无机盐稳定剂的混合物，通常CMI：MI=3：1[8]。卡松是一种优良的杀菌剂，广泛用于成品、化妆品、洗发水和护发素的成分中，是一种抑制微生物生长的防腐剂。卡松具有很强的生物活性，可以抑制细菌并杀死它们。可解决真菌感染引起的发酵、霉变、破坏、细菌过多等问题。还可用于化妆品、洗涤剂、工业消毒水、机床冷却液、油漆等，因为它对细菌粘液有渗透作用。作为一种环保型杀菌“绿色产品”，应用范围广泛。此类物质通常随生活和工业废水进入环境水体条件，通过降解反应在环境中被消化，同时受一定pH值、重金属等影响，降解速率不同，对环境有害，对水生环境和水生生物影响效果越来越严重。吕鹏[9]的研究实验证实其对斑马鱼的胚胎具有一定毒性，影响胚胎的血管发育、心率和体长等，所以其潜在的环境与健康风险不容忽视。

土壤酶是土壤的组成成分之一，是一种具有加速土壤生化反应速率功能的蛋白质[10，11]，在土壤生物化学过程中，它参与了许多与物质循环和能量流动有关的反应，可以说，不仅仅是土壤中的有机物质过氧化氢的执行者，也是植物营养素的活性库[12]。研究表明，土壤酶活性的高低可以表征土壤微生物活性的高低，也可以反映土壤养分转化和迁移能力的强弱。而且它对环境中重要的外部因素引起的变化非常敏感[13，14]。因此，在几乎所有生态系统的监测和研究中，土壤酶活性的检测已成为污染土壤生态毒理诊断的重要指标之一。

本研究通过测定PCPs中常用杀菌剂卡松和对羟基苯甲酸酯类中对羟基苯甲酸乙酯单独和复合污染下，对土壤酶(过氧化氢酶、蔗糖酶、脲酶)活性的影响以及对植物生长的毒性作用，来评估卡松和对羟基苯甲酸乙酯污染的毒性效应，旨在为个人护理品(PCPs)污染物的生态毒性和潜在健康风险的评价提出科学依据。

1 实验部分

1.1 供试土壤

土壤来自五点取样法提供的样品，样品取自拱墅区。搅拌均匀后，去除土壤表面的杂草和枯叶，选择耕地深度(0 cm-15 cm)进行取样。清除碎石和植物残骸后，取回的土样立即通过10目筛网备用。一部分用于测定土壤的理化性质，如表 1 所示。剩余的土壤在(25±1)℃恒温箱内预培养7天后进行后续实验。

表1 供试土壤理化性质

1.2 实验仪器和试剂

30%过氧化氢、硫酸、次氯酸钠、二硝基水杨酸(上海凌峰化学试剂有限公司)、高锰酸钾、蔗糖(广东光华科技股份有限公司)磷酸氢二钠、磷酸二氢钾(湖州湖试化学试剂有限公司)、葡萄糖、酒石酸钾钠硫酸铵(西陇化工股份有限公司)尿素、柠檬酸(国药集团化学试剂有限公司)氢氧化钾、氢氧化钠(杭州萧山化学试剂厂)、苯酚(永华化学科技有限公司)、无水乙醇(安徽安特食品股份有限公司)、甲醇、丙酮、甲苯(杭州双林化工试剂有限公司)均为分析纯，水为二次沸腾蒸馏水。

烧杯、三角瓶、玻璃棒、漏斗、电子天平、双面滤纸、试管及试管架、移液管、可见光分光光度计等。

1.3 酶活性试验方法

称取200 g试验土壤放入500 mL锥形瓶中，加入适量溶液使土壤中对羟基苯甲酸乙酯和卡松的浓度分别为50 mg/L、200 mg/L、1000 mg/L、5g/L，同时设置空白对照(空试验组不加任何农药，只加等量的蒸馏水)对羟基苯甲酸乙酯和卡松加入土壤中，充分混合。前测每3天测量一次，在培养3、6中，9天、12天、15天、18天、21天、24天、27天和30天定期取样，每个测量组的每个浓度重复取2个样品，每次测量的取样量约为2.00 g，取样后，将每个样品用保鲜膜包好，放入25 ℃恒温箱中保存。土壤脲酶活性采用苯酚钠-次氯酸钠比色法[15]测定；土壤过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法[16]测定；土壤蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水杨酸比色法[16]测定。

1.4 PCPs对植物生长的影响实验

选择大小相同、健康丰盈的凤仙花种子，按体积比1：3加入80 ℃蒸馏水3浸润3 min，室温下蒸馏水浸泡24小时。种子发白后，调至直径9 cm双层滤纸将其铺展。在带滤纸的培养皿中，每盘 20 个种子。向培养皿中加入 10 mL 不同浓度的卡松和对羟基苯甲酸乙酯溶液，并将它们放入人工气候箱中。每个浓度设置 3 个平行组。培养设定温度为(22±1)℃，湿度为(80±5)%，每24小时加水一次。播种后24小时开始记录发芽率，每天定时观察，直至对照组种子发芽率不再变化，此时记录发芽率。

每盆加入500 g土，加入不同浓度的卡松和对羟基苯甲酸乙酯，搅拌均匀，放置7天，风干。在培养箱中加速种子的发芽，然后将发芽的种子10粒移入每盆，保持土壤水分含量在60%-70%，生长周期为7天。测定各试验组种子的芽长，计算芽长抑制率。

1.5 分析方法

1.5.1 标准曲线的绘制

脲酶标准曲线：

用移液管吸取10 mL氮的标准溶液，用容量瓶定容至100 mL，充分摇匀。从其中分别吸取0 mL、1.00 mL、3.00 mL、5.00 mL、7.00 mL、10.00 mL、13.00 mL移至50 mL比色管中，加水至20 mL，再加入4 mL苯酚钠溶液，充分混合。紧接着加入3 mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，静置20 min后，用蒸馏水稀释至刻度。将显色液在可见光光度计上于578 nm处，以1 cm比色皿进行比色测定，以试剂空白为参比。以标准溶液氮含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线如图1。

蔗糖酶标准曲线：

用移液管分别取0 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL、15 mL葡萄糖工作液于50 mL容量瓶中，加入3 mL，5-二硝基水杨酸溶液，摇匀后置于沸水中加热5 min，之后迅速在自来水流下冷却3 min，用蒸馏水定容至刻度。摇匀后在508 nm波长处比色测定吸光值，记录整理并绘制标准曲线如图2。

2 结果与讨论

2.1 单一实验中不同浓度的卡松、对羟基苯甲酸乙酯对土壤酶活性的影响

2.1.1 过氧化氢酶单一作用实验

图1 脲酶活性标准曲线表

图2 蔗糖酶活性标准曲线表

图3 不同浓度的卡松(0.05 g/L-5 g/L)暴露下的土壤过氧化氢酶活性柱状图

图4 不同浓度的对羟基苯甲酸乙酯(0.05 g/L-5 g/L)暴露下的土壤过氧化氢酶活性柱状图

外界污染物一旦进入土壤，就会通过氧化代谢作用被微生物分解，以降低其对微生物本身的毒性，同时为了保护自身免受氧化剂-过氧化氢的伤害，它必须产生过氧化氢酶来分解体内残留的过氧化氢。因此，微生物在初期受到污染物干扰时，会产生显著的过氧化氢酶活化作用。随着微生物对污染物的适应能力增强，这种活化作用逐渐减弱，最终恢复到稳定状态。图1为卡松对土壤过氧化氢酶活性的影响 。由图3可知，卡松在低浓度(0.05 g/L-0.2 g/L)时，前3天时呈抑制状态，从第6到第21天酶活性呈促进作用；当暴露24天时，卡松的酶活性呈现平稳趋势，逐渐与空白对照组酶活性接近。图4为对羟基苯甲酸乙酯对土壤过氧化氢酶活性的影响。由图2可知，在前21天暴露时，土壤酶活性呈促进趋势。到暴露时间为24天时，土壤过氧化氢酶活性也趋于平稳状态。说明实验初期，卡松、对羟基苯甲酸乙酯对土壤过氧化氢酶基本上表现出活化作用，过氧化氢酶活性呈显著上升趋势。随着土壤微生物对卡松、对羟基苯甲酸乙酯的适应性逐渐增强，它们的加入逐渐减慢了胁迫反应，从而在随后的试验阶段，各处理土壤样品中的过氧化氢酶活性逐渐恢复到稳态，过氧化氢酶的活性在每个处理土壤之间的差异就不那么显著。

2.1.2 脲酶单一作用实验

图5 不同浓度的卡松(0.05 g/L-5 g/L)暴露下的土壤脲酶活性柱状图

图6 不同浓度的对羟基苯甲酸乙酯(0.05 g/L-5 g/L)暴露下的土壤脲酶活性柱状图

供试土壤脲酶活性受到卡松的变化如图5所示，随着暴露时间的增长，各处理组的(包括对照组)土壤脲酶活性基本上呈现出酶活性先抑制再促进再抑制最后促进的趋势；同一处理时间，土壤脲酶活性在不同浓度卡松处理下的表现并不一致。与对照组相比，受到50 mg·L-1-200 mg·L-1浓度处理的组在前12天受到抑制作用，其中1000 mg·L1卡松处理组在第6天时酶活性显著下降，表现为对土壤脲酶活性的抑制；1000 mg·L-1-5000 mg·L-1卡松处理组在第24 天时显著升高，表现为对土壤脲酶活性的促进作用；处理后第21 天，各浓度处理的土壤脲酶活性均高于対照组，且随着时间的延长，各浓度组的酶活性增加呈上升的趋势，在1000 mg·L-1处理下的酶活性受卡松的影响最明显。对羟基苯甲酸乙酯处理后，低浓度处理(50 mg/L、200 mg/L)的土壤脲酶活性得到一定的抑制，其中200 mg/L浓度的抑制时间比高浓度组的长，从21天开始才起促进作用，后面逐渐恢复到对照水平；高浓度处理(1000 mg/L、5000 mg/L)在试验开始后就抑制了土壤脲酶活性，且抑制效果非常显著，且这种抑制作用在第9天时达到最大值，随后酶活性开始上升。随着试验时间的延长，高浓度处理土壤脲酶活性开始慢慢恢复，直到27天逐渐恢复到对照水平。

2.1.3 蔗糖酶单一作用实验

图7 不同浓度的卡松(0.05 g/L-5 g/L)暴露下的土壤蔗糖酶活性柱形图

图8 不同浓度的对羟基苯甲酸乙酯(0.05 g/L-5 g/L)暴露下的土壤蔗糖酶活性柱形图

由上图可知，土壤蔗糖酶活性受到明显的抑制，卡松在12天时抑制作用达到最高峰，200 mg/L的酶活性抑制时间最长，到24天后酶活性开始恢复，到28天后，所有处理组的土壤蔗糖酶活性恢复到对照水平左右，30天时酶活性都高于对照组，起促进作用。对羟基苯甲酸乙酯在9天时抑制作用达到最高峰，200 mg/L的酶活性抑制时间也是最长，低浓度组(50 mg/L、200 mg/L)在24天后酶活性开始上升，高浓度组(1000 mg/L、5000 mg/L)在27天左右酶活性开始上升，到第30天时，卡松和对羟基苯甲酸乙酯的酶活性都恢复到対照组水平左右。蔗糖酶是表征土壤生物活性的一种重要水解酶。一般来说，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越强。因此，转化酶不仅可以表征土壤生物活性的强弱，而且可以作为评价土壤成熟度和肥力的重要指标之一。本研究发现土壤蔗糖酶活性在使用卡松后受到了抑制，卡松的浓度越高，抑制作用越明显，后期可以恢复到对照水平。这可能是由于卡松能够作为一类杀菌剂，对蔗糖酶的微生物生存和数量造成影响，抑制其生长，从而使蔗糖酶活性被抑制，但随着卡松在环境中不断降解，卡松的含量逐渐减少，蔗糖酶活性恢复到对照值并逐渐上升。对羟基苯甲酸乙酯作为一种防腐剂，经赵晓俊[6]等人的研究表明，其对生物具有一定的生殖毒性，可能对羟基苯甲酸乙酯抑制了土壤中蔗糖酶微生物的繁殖，造成了蔗糖酶活性的丧失，随着对羟基苯甲酸乙酯在环境中的降解作用，蔗糖酶活性也开始逐渐上升。

2.4 PCPs对植物生长的影响实验

①凤仙花种子发芽率的测定

表2 不同浓度的卡松对凤仙花种子发芽率的影响

表3 对羟基苯甲酸乙酯对凤仙花种子发芽率的影响

由上述图表可知，卡松浓度为0.05 g/L-5 g/L时，5000 mg/L的卡松对凤仙花种子的发芽抑制率最高。1000 mg/L的卡松时凤仙花种子的发芽率最高，抑制率最小。低浓度(50 mg/L、200 mgL)时凤仙花种子发芽率相同，抑制效果较弱。对羟基苯甲酸乙酯在低浓度(50 mg/L、200 mg/L)时凤仙花种子的发芽较高，抑制效果较低；在高浓度(1000 mg/L、5000 mg/L)较低，抑制效果较高。在200 mg/L时，抑制效果最不明显。

②凤仙花种子生长状况的测定

表4 不同浓度的卡松和对羟基苯甲酸乙酯对凤仙花种子的根长抑制

由上述表可知，卡松对凤仙花的根长抑制效果比羟基苯甲酸乙酯明显。卡松在50 mg/L和5000 mg/L时，对凤仙花的根长抑制效果最明显，对羟基苯甲酸乙酯在1000 mg/L对凤仙花的根长有一定的抑制效果，其他浓度抑制效果不明显。

表5 复合物对凤仙花的发芽率和根长抑制

2.5 卡松和对羟基苯甲酸乙酯对土壤微生物的联合毒性实验

复合染毒实验采用正交法和控制变量法，分别以卡松浓度和对羟基苯甲酸乙酯浓度为变量设置实验组。每组设置3个平行组，实验结果取平均值。具体设置如图9-11所示。

由图9可知，复合浓度下过氧化氢酶的活性呈上升趋势，起促进作用。由图10可知，复合浓度下脲酶随着暴露时间的延长，酶活性逐渐下降，起抑制作用。在第12天时，酶活性为0，土壤脲酶失去活性。由图11可知，复合浓度下蔗糖酶的活性呈上升-下降-上升趋势。在前15天，酶活性被激活，起促进作用。第15天后，酶活性受到抑制，到21天左右，酶活性恢复到対照组水平。

3 结论

综上所述，除了过氧化氢酶外，卡松的使用总体上会抑制其他几种土壤酶的活性，低浓度(200 mg/L)的卡松对各种酶的影响时间比较持久，且到试验后期基本都能恢复到对照水平，高浓度处理影响土壤酶的活性时间较短，但是最终都能恢复到对照水平。对羟基苯甲酸乙酯对过氧化氢酶有一定的促进作用；对脲酶、蔗糖酶都有一定的抑制作用，脲酶在1000 mg/L时抑制效果最明显；蔗糖酶低浓度抑制时间比高浓度长一点。植物实验中卡松高浓度时抑制发芽率较明显，卡松低浓度对抑制效果较弱；根长抑制率中50 mg/L、5000 mg/L时抑制效果明显，50 mg/L、200 mg/L时的抑制效果较接近，但对羟基苯甲酸乙酯抑制发芽率不明显。但在浓度为1000 mg/L时对凤仙花的根长有一定的抑制效果，其他浓度抑制效果不明显。复合下，脲酶失去活性，过氧化氢酶呈促进效果但后期酶活性恢复到对照水平，而蔗糖酶活性呈上升-下降-上升趋势。

图9 复合浓度(1 g/L-1 g/L)下的暴露下的土壤过氧化氢酶活性折线图

图10 复合浓度(1g/L-1g/L)下的暴露下的土壤脲酶活性折线图

图11 复合浓度(1 g/L-1 g/L)下的暴露下的土壤蔗糖酶活性折线图

4 展望

污水处理厂的污泥和动物粪便经常被用于农田施肥，但是吸附在污泥中的PCPs和动物粪便中代谢不完全的PCPs会给土壤造成的一定的污染。目前关于土壤中PCPs迁移转化规律的研究很少。而土壤酶活性作为检测土壤肥力的重要指标之一，给土壤中PCPs迁移转化规律的发展提供了新的方向和素材。现有的处理工艺并不能完全去除PCPs[]，也为以后如何治理土壤中的PCPs提供了新的分析。卡松作为一种新型杀菌剂，具有高效、低毒、药效持续时间长、对环境安全等优点，在海洋防污、工业循环冷却水处理、工业产品防腐、农用杀菌等方面具有广泛应用，通过本次研究卡松对植物生长影响行为及生态毒性来引起人们的高度重视，使它作为产品能在生产生活中朝日渐流行的绿色趋势发展，也将更加有利于规范PCPs在工业生产方面的使用。一直以来，对羟基苯甲酸乙酯都被认为是一类安全、有效的防腐抗菌剂，在化妆品、个人护理产品和医药产品等多种消费品中被广泛使用。然而研究表明该类物质具有一定的雌激素效应，对人体有一定的生殖毒性。通过本次实验对羟基苯甲酸乙酯对植物生长影响行为及生态毒性，为进一步研究该类物质对生态环境的毒性机制以及对土壤微生物、植物毒性影响等提供实验数据，为该类物质的安全性评价提供实验支撑。