血红蛋白类氧载体在肾移植中的应用前景

王欢 周文涛 刘嘉馨 王红

肾移植是治疗终末期肾病的首选方法[1]。随着全球肾衰竭患者数量的增加，肾脏供需差距不断扩大，供肾短缺使人们将视线转向了边缘供者，如心脏死亡器官捐献（donation after cardiac death，DCD）供者和扩大标准供者（expanded criteria donor，ECD）[2-3]。在肾移植过程中，肾脏必然会发生一定程度的缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI），不仅会严重影响移植肾的早期功能，也不利于受者长期存活。此外，从边缘供者获取的供肾对IRI更为敏感，更易发生迟发性病变或功能障碍，影响受者预后[4-6]。因此，在肾移植过程中，采用有效的器官修复和保存技术是保证移植成功的重要前提。传统冷保存是目前临床上最常用的一种保存和运输器官的方法，但采用该方法对供器官进行长时间保存会导致组织损伤，增加器官功能评估难度，降低器官修复机会[7]。因此，器官保存技术亟待改善。

目前，缺血或缺氧是造成器官保存困难的原因之一，由于缺乏血液供应，器官在保存过程中因缺氧等原因导致质量逐渐下降[8-10]。因此，为器官保存过程提供足够的氧气具有重要意义。目前使用的机械灌注方法，如低温机械灌注（hypothermic machine perfusion，HMP）、常温机械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）以及仍处于动物及临床前研究阶段的亚常温机械灌注（subnormothermic machine perfusion，SNMP）和控制性携氧复温（controlled oxygenated rewarming，COR）灌注等可携带部分氧气进入器官，在器官保存和移植方面已经取得了一定的成效[11]。有研究表明，与器官保存液相比，采用血液保存器官更符合生理条件，保存效果更佳，但由于血液临床应用的局限性使人们转向对氧载体的研究[12-13]。初步研究显示，血红蛋白类氧载体（hemoglobin-based oxygen carrier，HBOC）可以提高组织氧合程度并改善异体移植物的功能[14-15]。本文通过对目前供肾保存的现状、供肾保存过程中的损伤机制以及HBOC在肾移植中的应用进行总结与展望，为器官移植的相关研究和临床应用提供新的视角。

1 供肾保存的研究现状

供肾保存的主要目标是减轻损伤。虽然静态冷保存仍是首选保存方式，但在临床前研究中，机械灌注在供肾保存上显现出一系列更有益的效果，部分保存方式正逐渐应用于临床工作中，而氧气的加入在减轻IRI、提高供肾质量、改善受者预后方面发挥着重要作用。

1.1 传统冷保存

传统冷保存是目前临床常用的器官保存方式，其通过营造低温环境来降低器官新陈代谢，并相应地减少氧气需求。然而，研究表明，即使将温度控制在4 ℃，肾脏的代谢率仍保持在10%左右，细胞仍然需要氧气来维持基本代谢，导致离体肾脏能承受的缺血时间有限[16]。肾脏储存时间越长，氧气缺乏越严重，移植后再灌注损伤的程度就越重，而提供氧气可以帮助线粒体再合成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），延缓损伤过程。因此，研究如何在保存过程中为肾脏提供足够的氧气具有重要意义。

1.2 机械灌注保存

机械灌注通过控制性灌流来维持内皮细胞功能。在内皮一氧化氮合酶作用下，内皮细胞释放血管舒张因子——一氧化氮来扩张血管，调节血液流动，改善肾脏皮层微循环[17]。有研究表明，HMP（4～6 ℃）通过将低温与体外机械灌注相结合的方式，在改善肾移植预后方面具有一定效果[15]。Darius等[18]研究发现，从肾脏获取到移植期间，在HMP过程中持续给氧可以更好地调节肾脏血流状况，改善早期移植物功能。NMP（35～38 ℃）是一种在生理条件下灌注器官以维持其代谢活性的方法。Nicholson等[19]研究发现，与静态冷保存相比，短时间（1～2 h）的NMP可以更快恢复缺血肾脏功能，减少肾移植后不良反应的发生，改善受者预后。SNMP（20～34 ℃）是介于HMP和NMP之间的一种保存方式，Shonaka等[20]研究发现，在SNMP期间，用HBOC灌注能够增加供器官氧气消耗，改善氧代谢。COR灌注（8～20 ℃）是一种将灌注液温度逐渐升高的器官灌注方法，其目的是减少对移植物的损伤，改善再灌注后的细胞功能。Minor等[21]研究发现，冷保存后进行COR灌注能够更好地恢复肾功能，降低细胞凋亡程度。

1.3 氧气输送保存

氧气输送保存的方法可与静态冷保存或机械灌注同时使用以改善供肾质量。在供肾保存过程中，氧气可以通过各种技术输送，常用方式有输注氧合灌注液或全氟碳化合物（per fluorocarbon，PFC）、高压氧灌注、逆行氧灌注等[8]。研究表明，在肾脏遭受热或冷缺血损伤后，这些氧气输送方式有助于恢复细胞ATP水平[9]。Flatmark等[22]发现，离体肾脏经氧合灌注后再进行移植，移植肾功能可迅速恢复。Kalenski等[23]比较了离体DCD猪肾在氧合灌注和冷保存下保存24 h后的肾功能状况，结果发现氧合灌注较冷保存更有利于维持肾功能。虽然氧气输送在一定程度上改善了器官保存质量，但在保存过程中，肾脏内的实际含氧量以及耗氧量不能确定。此外，高压氧灌注等方式难以保证氧气在器官中的合理分布，在没有IRI的情况下，过度氧合对肾脏可能没有好处，过多的氧气供应反而会造成进一步的损伤。因此，必须注意灌注氧量，以适当平衡缺氧时ATP的产生和氧化应激的发展为目标[24]。使用氧载体适当缓冲氧气摄入，并保证其在整个器官中扩散是解决问题的方法之一。

2 供肾保存过程中损伤的机制

供者类型对器官的质量和器官对低温的耐受能力有着关键的影响[24]。在供肾保存过程中，低温和缺氧会造成离子失衡和细胞损伤，导致肾脏代谢功能障碍；再灌注后，在保存过程中损伤的基础上，自由基产生导致膜脂质过氧化、蛋白质和DNA氧化损伤，与炎症和免疫反应等共同作用，诱导细胞死亡[17,25-26]。

肾组织氧合是由动脉血中的氧、细胞消耗的氧以及动脉-静脉氧分流所共同决定的。在人体中，肾脏的耗氧量仅次于心脏。生理条件下，流向肾皮质的血液中所含的氧主要用于肾小球的滤过和肾小管的重吸收，相比之下，肾髓质的血流量较低，主要用于维持肾内的渗透压梯度以增加尿液浓度[24,27]。在供肾保存过程中，血液流动被暂时阻塞导致肾脏缺血缺氧，从而严重影响肾脏细胞的生理。

供肾在保存过程中的损伤机制大多与IRI相关，主要包括氧自由基增多、抗氧化酶系统失调、细胞内钙离子超载、中性粒细胞激活和一氧化氮合酶激活等，它们相互影响，共同导致肾损伤[17,25,28]。肾移植后，人体血流刺激肾脏产生氧自由基，引起肾脏细胞膜脂质过氧化，蛋白质和DNA氧化损伤，进而加重细胞死亡，造成肾损伤。内皮细胞和微血管是IRI的关键靶点，对缺氧环境高度敏感。肾组织缺氧后，与缺血性损伤相关的缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）信号通路受损，HIF-1α产生增加[9,29]。目前，HIF依赖的信号通路和HIF脯氨酸羟化酶是缺血性疾病药理干预的靶点之一[24]，通过直接提供氧气可能更容易防止该途径的激活。

3 血红蛋白类氧载体在肾移植中的应用

红细胞是一种良好的天然氧载体，可以用于器官保存。但由于血液供应紧张，且存在配型不合和潜在病原体等问题，无法在器官保存中广泛应用[30]。为此，人们将目光转向一类具备携氧、扩容、无病原体感染、无需配型、能够长期保存等特点的血液替代品，即人工合成的氧载体[31-32]。2019年，Vrselja等[33]发表在《Nature》的一项研究发现，用HBOC-201进行氧气输送可以恢复离体猪脑的血液循环，并使其在离体状态下维持正常的细胞代谢及神经活动长达36 h，证明了HBOC对离体猪脑的保护作用，引起了研究者们对氧载体的广泛关注。在器官保存方面，目前研究的氧载体主要有PFC类氧载体和HBOC[34]。PFC是一种具有很高携氧能力的惰性化合物，其释放氧气的过程不受温度影响，能够创造一个高度含氧的环境。有研究显示，虽然PFC能够通过提供氧气促进器官产生足量的ATP，维持器官基本代谢功能，但PFC所携带的氧气是否能够通过密度更高的器官或组织释放，目前仍广受质疑[35]。研究发现，在供肾保存方面，PFC在大鼠模型中能够降低血清肌酐水平，减少肾组织损伤，提高大鼠存活率；但应用于猪模型时，与使用现有威斯康星大学保存液（University of Wisconsin solution，UW液）相比，用PFC保存的肾脏表现出炎症增加，内皮损伤以及肾功能降低[36-37]。此外，由于PFC单一的携、释氧特性，其在器官保存中的应用有限。

HBOC是一类经过修饰的人或动物源性血红蛋白的产物，具有为人体组织器官输送氧气的功能，由于没有细胞膜，其携氧、释氧效率远高于红细胞[32]。此外，HBOC具有流变学优势，可以更好地维持微血管血流量和组织氧合。在器官保存方面，HBOC的应用能够改善离体器官缺血缺氧的状态，为进一步改善离体器官质量、提高移植成功率提供了可能。在供肾保存方面，目前研究主要集中在HBOC-201和M101，其他HBOC在供肾保存方面的研究还处于起步阶段[24,38]。目前，国内外多个团队以海洋蠕虫、牛血和过期人血等不同原料制备HBOC，通过静态冷保存或机械灌注对大鼠、猪等动物的不同器官进行保存，均取得了一定的效果（表1）[12,20,38-47]。

表1 HBOC在器官保存中的应用的文献报道Table 1 Literature reports on the application of HBOC in organ preservation

3.1 HBOC-201在肾移植中的应用

HBOC-201是用戊二醛做交联剂，通过分子内和分子间交联形成的聚合牛血红蛋白溶液，平均相对分子质量为250。与人血红蛋白[血红蛋白氧饱和度为50%时的氧分压（P50）=27 mmHg，10 mmHg=1.33 kPa]相比，HBOC-201具有较低的氧亲和力（P50=38 mmHg），能够有效向组织供氧。HBOC-201分别于2001年和2011年在南非和俄罗斯获准用于急性贫血的治疗[48]。

在器官保存方面，HBOC-201目前主要用于肝脏和肾脏的临床前研究。在肝移植模型中发现，HBOC-201的SNMP有助于快速减轻炎症反应，从而更好地恢复术后移植物功能。在常温条件下，用HBOC-201代替红细胞和新鲜冰冻血浆灌注肝脏，能够有效减轻肝损伤[38]。这些发现推动了HBOC-201在其他器官保存方面的研究。

在肾移植中，研究显示HBOC-201是一种良好的血液替代品。Aburawi等[12]在肾脏NMP试验中，通过监测肾动脉阻力、能量储存以及组织学表现等情况，发现与浓缩红细胞相比，HBOC-201并未引起额外的损伤，可以作为血液替代品用于器官保存。在亚常温条件下，Bhattacharjee等[39]发现肾脏在热缺血30 min后，用保存液冲洗并用HBOC-201进行静态冷保存或机械灌注保存肾脏4 h，与用血液保存肾脏相比，二者的氧饱和度没有显著差异；再灌注时，两组肾脏具有相似的肾血流量和功能，表明HBOC-201是一种能够替代血液的良好氧载体。从低温到常温的逐渐复温灌注是一种新的灌注方式，在4～7 ℃的温度范围内HBOC-201是否可以在肾脏复温期间使用，需要进一步的研究。Mahboub等[40]将HBOC-201应用于大鼠肾脏逐渐复温灌注中，发现HBOC-201组表现出较好的肾功能、肾小球滤过率和钠重吸收率，并且复温后肾功能恢复更好。器官保存是一个多因素共同影响的复杂过程，从氧气供应方面，相关研究均展现了HBOC-201在器官保存方面的可行性，但在不同器官和不同保存条件下的保存效果以及移植后器官功能恢复情况仍有待研究。

3.2 M101在供肾保存中的研究

M101是从海洋蠕虫中分离出来的一种高分子量（相对分子质量3 600 ）的生物聚合物，具有很高的氧结合能力，饱和时可携带156个氧分子（人血红蛋白饱和时可携带4个氧分子）。它能够梯度释放氧气，并具有超氧化物歧化酶样活性，可防止潜在有害的血红素相关自由基产生和血红蛋白降解产物释放。在器官保存液中加入M101可为缺氧环境提供适量的氧气，防止组织中氧含量下降[41,49]。

在肾脏、肺脏、心脏等器官移植的临床前模型中，研究表明M101能改善各类器官质量、功能和预后[42-44]。在供肾保存方面，将M101用于猪肾近端肾小管细胞（LLC-PK1细胞）的静态冷保存中发现，加入一定剂量的M101能提高细胞活力。在使用冷保存方式保存的猪肾自体移植模型中，M101的加入提高了肾功能恢复的速度，降低了肾脏炎症水平，并维持肾组织结构完整性[41]。Kaminski等[46]发现，在冷保存条件下，M101改善了肾脏的长期功能；在机械灌注条件下，M101可以同时改善肾脏短期和长期功能并维持组织完整性，减缓肾间质纤维化和肾小管萎缩的进程。此外，研究纯氧与M101对猪肾移植的影响发现，在机械灌注条件下，无论是否添加纯氧，补充M101均有助于移植肾功能的恢复，减少移植后不良反应的发生[45]。目前的研究表明，在不同保存方式下加入M101对供肾保存均有良好效果，部分研究已进入临床研究阶段。将M101作为器官保存液添加剂的 60 例肾移植安全性研究（NCT02652520，https://clinicaltrials.gov/）证实，使用M101是安全的，并能显著减少移植物功能延迟恢复（delayed graft function，DGF）的发生，缩短肾功能恢复时间。另一项将M101作为氧载体添加到供肾保存液中用于终末期肾病患者肾移植的研究（NCT04181710，https://clinicaltrials.gov/），以观察M101 作为标准器官保存溶液的添加剂用于预防肾移植术后DGF的效果为主要目的，目前已进入临床Ⅱ期研究，有望在临床器官移植中尽早应用。

4 展 望

在肾移植研究方面，HBOC能够有效进行携氧、释氧，以满足器官保存的需求，其中HBOC-201和M101均有良好的效果。在器官保存中，保存方式、氧合策略和温度选择等多种因素影响器官的保存质量，缺氧或氧过载均不利于器官保存。HBOC从一定程度上解决了供肾保存过程中的缺氧损伤问题，为进一步改善心、肝、肺等其他器官的保存效果提供了可能。在后续研究中，将HBOC与不同保存方式相结合，研究合适的剂量范围、不同P50的HBOC制品对不同器官的保存效果等，建立更加有效的保存方式，为不同供者确定具体方案，包括对供者和器官进行准确评估，以便充分利用供者器官。已有研究报道，在器官获取、保存与移植的全过程中，无缺血器官移植技术不中断器官血流，能够有效避免IRI的发生，最大程度地改善移植预后[50]，这也为HBOC的应用提供了新机遇。同时，随着技术的不断改进，深入研究HBOC在器官保存和修复方面的效用及相关作用机制，通过合理的方式对其进行动态干预，优化氧合温度等因素在器官保存中的作用条件，为建立器官移植库提供了可能。