肝移植对胆道闭锁儿童肠道菌群的影响

宋伟 孙丽莹 朱志军 魏林 曲伟 曾志贵

胆道闭锁是一种原因未明的、以肝内外进行性炎症和纤维化为特征的罕见新生儿疾病[1]，发病率为1/12 000～1/5 000[2-3]，是最常见的小儿肝移植适应证[4]。既往研究表明，肝病患者肠道菌群易发生紊乱，并通过“肠-肝轴”影响肝脏的结构或功能，参与疾病的发生发展过程[5-8]。肠道菌群受多种因素影响[9]，如机体免疫状态、肝移植术中的缺血-再灌注损伤、服用抗生素和益生菌等[10-11]。已有研究证明胆道闭锁儿童的肠道菌群易发生紊乱[12]，但是肝移植对胆道闭锁儿童肠道菌群的影响尚无研究和报道。本研究旨在探讨肝移植对胆道闭锁儿童肠道菌群的影响，为肝移植治疗儿童胆道闭锁提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象

将2017年9月至2019年6月在首都医科大学附属北京友谊医院等待肝移植的胆道闭锁儿童纳入此次研究，通过临床资料、血生化指标、影像学资料及肝脏病理等确诊胆道闭锁。最终纳入16例，男6例，女10例，年龄8（6，12）个月，体质量指数为16.9（15.3，19.3）kg/m2。肝移植术后长期给予免疫抑制剂治疗，术后5～7 d给予抗生素预防感染。粪便样本采集日期距离上次抗生素服用时间为136（125，140）d。健康对照组10名，男4名，女6名，年龄8（7，12）个月，体质量指数为18.8（17.9，20.1）kg/m2。

纳入标准：（1）年龄<3周岁；（2）样本采集前近1个月内未服用过抗生素类药物或胃肠动力药；（3）近期未患腹泻及其它肠道疾病；（4）无全身细菌、病毒或真菌感染。排除标准：（1）患其他肝脏疾病，如进行性家族胆汁淤积症、Alagille综合征等；（2）近1个月内服用乳酸菌或其他益生菌的药物或食品；（3）近1个月内出现便秘或腹泻；（4）合并其他脏器疾病（肠道外），如胰腺炎、自身免疫性疾病等。

1.2 研究方法

1.2.1 肠道菌群检测 采集符合纳入和排除标准的胆道闭锁儿童肝移植术前粪便，4 h内放于−80 ℃冰箱储存。对患儿随访至术后6个月，再次采集粪便，保存方法与术前一致。采用QIAamp®Fast DNA Stool Mini试剂盒，按照说明书步骤提取粪便DNA，并用琼脂糖凝胶电泳分析DNA的纯度和完整性，采用Qubit精确定量DNA浓度。

宏基因组DNA文库构建与测序：（1）在flow cell加入DNA聚合酶和4种荧光标记的dNTP，每次循环只掺入单种碱基；（2）激光扫描芯片 flow cell表面，捕捉荧光信号，读取每条模板序列聚合上的核苷酸种类；（3）将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端黏性，继续掺入第2轮单种碱基；（4）依次统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。

1.2.2 生物信息学分析 原始序列进行质控后，比对物种数据库，分析样品中的物种组成；组装、基因预测，并在此基础上进行功能注释。应用R语言对肠道菌群数据进行分析，分析术前和术后肠道菌群组成、基因数量和代谢功能的改变。通过R软件corrplot包或gplots包绘制热图，分析物种与环境因子之间的关系。

1.2.3 肝功能检查 收集并整理患儿肝移植术前及术后的肝功能指标，包括丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、γ-谷氨酰转移酶（γ-glutamyl transferase，GGT）、 总 胆 汁 酸（total bile acid，TBA）和总胆红素（total bilirubin，TB）。分析肠道菌群与肝功能指标的相关性。

1.2.4 肝移植术后肠道微生物恢复程度分析 采集10名健康儿童的粪便进行测序和比较，分析胆道闭锁儿童肝移植术后肠道微生物的恢复程度。在整体结构上，比较肝移植术后组与健康对照组的物种多样性指标，包括α多样性和β多样性。α多样性采用Simpson和Shannon-Wiener指数计算，代表物种组成的丰度和均匀度。β多样性采用PCoA分析，代表两组样本间物种组成的差异度。

1.3 统计学方法

使用R v.3.3.1软件包对肠道菌群进行统计学分析。采用非参数Wilcoxon秩和检验分析肝移植术前组和肝移植术后组肠道菌群差异物种、基因及代谢通路的组成，P<0.05或错误发现率（false discovery rate，FDR）<0.1为差异有统计学意义。采用线性判别分析效应值（linear discrimin analysis effect size，LEfSe）分析肝移植术后组与健康对照组肠道菌群的差异物种：非参数Kruskal-Wallis秩和检验检测丰度差异特征，并找到与丰度有显著性差异的类群，线性判别分析（linear discrimin analysis，LDA）估算每个物种丰度对差异效果影响的大小，LDA评分越高，表明差异越显著。LDA评分临界值为2.0，LDA>2.0代表差异有统计学意义。采用Spearman相关性分析检验不同样本间基因、肝功能指标与肠道微生物间的相关性，P<0.05为差异有统计学意义。

人口统计学基本特征及临床资料采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。对于非正态分布的计量资料以中位数（下四分位数，上四分位数）表示，比较采用符号秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肝移植术后肠道菌群物种结构及功能组成的改变

肝移植术前组和肝移植术后组肠道菌群有1 164个共有物种，另外有158个和344个物种分别单独存在肝移植术前组和肝移植术后组，肝移植术后物种的数量较术前增加（图1）。

图1 肝移植术前组和肝移植术后组肠道菌群物种数量的韦恩图（属水平）Figure 1 Venn diagram of the number of intestinal micro flora species in the pre- and post-liver transplant group（genus level）

肝移植术后肠道菌群发生了明显改变。肠杆菌（Enterobacter）、耶尔森菌（Yersinia）、摩根菌（Morganella）、沙雷菌（Serratia）等机会致病菌在肝移植术前组富集，罗斯氏菌（Roseburia）、真杆菌（Eubacterium）、布劳特氏菌（Blautia）、梭菌（Clostridium）、阿克曼氏菌（Akkermansia）等产短链脂肪酸菌在肝移植术后组富集（均为P<0.05，表1）。

表1 肝移植术前组和肝移植术后组丰度发生改变的物种（属水平）Table 1 Species with altered abundance in the pre- and post-liver transplant group（genus level）

肝移植术后组肠道菌群基因数量较肝移植术前组增加，差异有统计学意义（图2A，P<0.05）。Spearman相关性分析结果显示同组间的肠道菌群基因呈正相关，不同组间的肠道菌群基因呈负相关（均为P<0.05，图2B）。

图2 肝移植术前组和肝移植术后组肠道菌群基因数量比较及相关性分析Figure 2 Comparison and correlation analysis of the number of intestinal micro flora genes in the pre- and post-liver transplant group

在功能代谢通路上，两组菌群的代谢通路发生了明显改变。肝移植术后组氨基酸代谢（amino acid metabolism）、脂代谢（lipid metabolism）、能量代谢（energy metabolism）、碳水化合物代谢（carbohydrate metabolism）、辅助因子和维生素代谢（metabolism of cofactors and vitamins）等代谢通路增强，而膜转运（membrane transport）、细菌感染（infectious diseases: bacterial）、药物抵抗（drug resistance）、多聚糖代谢（glycan biosynthesis and metabolism）、免疫系统疾病（immune diseases）等代谢通路减弱（图3）。

2.2 胆道闭锁儿童肝移植术后肠道菌群的恢复程度

与健康对照组比较，肝移植术后组肠道菌群多样性和菌群结构差异均无统计学意义（图4，均为P>0.05）。但两组间仍存在差异物种，克雷伯菌（Klebsiella）、肠球菌（Enterococcus）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae bacterium 291 EBAC）等机会致病菌和ε15样病毒（Epsilon15likevirus）在肝移植术后组富集，粪杆菌（Faecalibacterium）、真杆菌（Eubacterium）、布劳特氏菌（Blautia）、罗斯氏菌（Ruminococcus）等肠道有益菌在健康对照组富集（图5，均为P<0.05）。

图3 肝移植术前组和肝移植术后组肠道菌群功能代谢通路比较Figure 3 Comparison of functional metabolic pathways of intestinal micro flora between the pre- and post-liver transplant group

图4 肝移植术后组与健康对照组肠道菌群多样性和菌群结构比较Figure 4 Comparison of intestinal micro flora diversity and structure between post-liver transplant group and healthy control group

图5 肝移植术后组与健康对照组差异物种比较Figure 5 Comparison of species between post-liver transplant group and healthy control group

2.3 肝移植改变的菌群与肝功能指标间的关系

胆道闭锁儿童肝移植术前组及肝移植术后组肝功能指标结果见表2，与肝移植术前组比较，肝移植术后组肝功能指标均呈下降趋势，差异均有统计学意义（均为P<0.000 1）。肝移植术后发生早期感染3例，门静脉血栓1例，其余患者生存良好。

表2 肝移植术前组和肝移植术后组肝功能指标比较Table 2 Comparison of liver function indexes between pre- and post-liver transplant group[M(Q25,Q75)]

肠道菌群与肝功能指标间的Spearman相关性分析见图6，肠道有益菌如阿克曼氏菌（Akkermansia）、罗斯氏菌（Roseburia）、真杆菌（Eubacterium）、布劳特氏菌（Blautia）、梭菌（Clostridium）等的丰度与肝功能指标呈负相关，而机会致病菌如沙雷菌（Serratia）、肠杆菌（Enterobacter）、耶尔森菌（Yersinia）等的丰度与肝功能指标呈正相关（均为P<0.05）。

图6 肠道菌群与肝功能指标的相关性分析热图Figure 6 Heat map of correlation analysis between intestinal micro flora and liver function indexes

3 讨 论

胆道闭锁是新生儿胆汁淤积性肝病中最常见的病因，临床表现以黄疸为主，肝移植是有效的治疗手段[1,13]。既往研究表明，终末期肝病患者的肠道菌群易发生紊乱[9,14-15]，且紊乱的肠道菌群在疾病发生发展过程中扮演重要角色[16]。本研究基于宏基因组测序技术，分析肝移植对胆道闭锁儿童肠道菌群物种和功能组成的影响。

有研究表明，不同类型的肝病引起的肠道菌群失调普遍存在菌群多样性下降、丰度减少的现象，在门、纲、目、科、属、种的水平上菌群结构与功能与健康对照人群相比均有显著改变[5,17-18]。肠道和肝脏通过“肠-肝轴”相互作用和联系，一方面，肠道细菌中的胆盐水解酶可以将肝脏分泌的初级胆汁酸代谢为次级胆汁酸，进而通过法尼醇X激活受体和G蛋白偶联胆汁酸受体1激活初级胆汁酸的合成[19-20]；宿主和微生物的内源性代谢产物及外源性代谢产物可以为机体提供维生素、氨基酸等能量物质并通过门静脉系统转移到全身[21]。另一方面，肝脏分泌的胆汁酸可以酸化肠道环境，降低肠道内pH值，抑制病原菌的生长，维持肠道内菌群的平衡状态[22-23]。肝脏发生疾病后，胆汁酸分泌减少、肠道环境改变、菌群失调、厌氧菌减少、兼性厌氧菌和需氧菌增加、机会致病菌和病原菌过度增长、肠道通透性增加，肠道来源的微生物通过门静脉循环易位到肝脏，激活肝脏内炎症反应，进一步加重肝脏损伤[19,22]。

根据菌群的特性可将肠道菌群分为3类：有益菌（如乳酸杆菌、双歧杆菌等）、有害菌（如沙门菌、金黄色葡萄球菌等）和中间菌（大肠埃希菌、肠球菌等）。中间菌在机体免疫功能减弱时成为潜在致病菌，引起机体损害。既往有文献证明肝移植可改善多种肝病的肠道菌群紊乱[24-29]，但目前尚缺乏关于胆道闭锁患者肝移植术后肠道菌群的研究。本研究发现胆道闭锁终末期肠道菌群中机会致病菌更为富集，肝移植术后6个月机会致病菌丰度明显下降，产短链脂肪酸菌丰度明显升高。短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等，乙酸能被大脑、心脏和外周组织氧化利用；丙酸可以影响肝脏和胆固醇代谢；丁酸能作为结肠上皮细胞的能量来源调节上皮细胞和免疫细胞的生长和凋亡、抑制结肠炎和结肠癌、调节氧化应激，并能影响黏液层的组成[30-31]。这表明肝移植不仅可以改善胆道闭锁患者的肝功能，还可在提高肠道菌群结构方面发挥重要作用。此外，肠道菌群的基因数量在肝移植术后显著增加，肝移植术前和肝移植术后组内基因之间呈正相关、不同组间基因呈负相关，表明肝移植术前组和肝移植术后组在肠道菌群功能代谢上存在差异。

本研究结果显示，能量代谢、氨基酸代谢、碳水化合物代谢、脂代谢等代谢通路在肝移植术后明显增强，而病原相关的代谢通路如细菌感染、免疫系统疾病等在肝移植术后减弱，与机会致病菌丰度在肝移植术后减少相对应。

肠道菌群受众多因素的影响，如抗生素和免疫抑制剂的使用、应激（术中缺血-再灌注损伤）、益生菌的服用等。本研究中胆道闭锁儿童肝移植术后肠道菌群虽明显改善，但尚未达到健康儿童的水平，可能是受到免疫抑制剂和既往应用抗生素的影响。随着肝移植术后时间的延长及机体免疫力的恢复，胆道闭锁儿童肠道菌群达到健康儿童水平仍需一段时间。此外，我们发现肠道有益菌丰度与肝功能指标呈负相关，而机会致病菌与其呈正相关。因此益生菌的使用除了可以改善肠道菌群紊乱以外，可能间接影响肝功能。综上所述，肝移植在一定程度上可以改善胆道闭锁儿童肠道菌群结构和功能的组成。