基于金纳米星和生物质多孔碳信号放大策略的新型电化学核酸适配体传感器

白 天，岳 爽，赵路阳，卫 敏*

1.河南省食品检验研究院，河南 郑州 450003

2.国家市场监管重点实验室(食品安全快速检测与智慧监管技术)，河南 郑州 450003

3.河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001

赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)是一种由青霉菌和曲霉菌产生的次级代谢产物，具有很强的肾毒性、肝毒性、免疫毒性和致畸致癌作用等，污染范围广泛[1]。因此，建立一种灵敏、有效的分析方法对OTA进行检测，对于维护食品安全及保护人类健康尤为重要。电化学核酸适配体传感器是一种将电化学检测方法与核酸适配体结合起来的新型传感器，由于具有特异性好、操作简单、易于实现现场检测等优点而受到广泛关注。目前利用电化学核酸适配体制备传感器，对提高检测灵敏度至关重要。

随着纳米技术的发展，越来越多的金纳米材料，如金纳米颗粒和金纳米棒等[2-4]，由于其比表面积大、导电性好和生物相容性好等优点，被广泛用作载体来固定多个标记物以实现信号放大，从而提高传感器的检测灵敏度。作为一种新型材料，金纳米星(GNSs)由于具有尖锐尖端的多分支结构，更适合于富集和检测生物分子[5]。Li等[6]研究表明，由于GNSs的特殊结构和形貌，其电催化效果优于商用金电极、金纳米颗粒和金纳米棒。由于碳材料具有比表面积大和良好导电性的优点，如石墨烯、多孔碳等，被广泛用作载体以增强电化学性能[7-10]。其中，生物质多孔碳材料因具有低成本、易获得、可重复生产、对环境友好，以及储量丰富等优点而受到广泛关注[11-13]。目前已有研究表明，在多孔碳材料中掺杂氮元素，能有效改善多孔碳分散性差的问题，提高材料的导电性和生物相容性[14]。但是，氮源一般是以有机试剂作为原料，成本较高，难以实现商业化。因此，选择成本低的小麦原料作为碳源和氮源来制备生物质氮掺杂多孔碳(NDPC)。

目前，关于使用GNSs或NDPC进行OTA电化学检测的报道几乎没有。因此，作者利用GNSs和NDPC作为双重信号放大策略，用于提高检测的灵敏度。制备的GNSs作为修饰材料，可以固载更多的OTA核酸适配体(Apt)和加速电极表面的电子转移，制备NDPC固载互补链(cDNA)和硫堇(Th)，构建Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE检测OTA，为食品安全检测提供了技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

OTA的核酸适配体(Apt)(5′-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAG CAT CGG ACA-HS-3′)、互补链(cDNA)(5′-CCA CAC CCG ATC-bio-3′)：上海生工生物股份有限公司。赭曲霉毒素A：Sigma-Aldrich公司。玉米样品购买于当地超市，将其研磨成粉后备用。

所有电化学试验均在CHI660E电化学工作站上进行。三电极系统：以金电极(AuE)为工作电极，饱和氯化银电极为参比电极，铂丝电极为对电极。JSM-7610F扫描电子显微镜(SEM)、JEM-2100透射电子显微镜(TEM)：日本JEOL。

1.2 试验方法

1.2.1 金纳米星(GNSs)的制备

采用柠檬酸钠一步还原法制备金种子溶液，再由生长溶液生长法生成GNSs[15]。

1.2.2 生物质氮掺杂多孔碳材料(NDPC)的制备

模板SiO2球的制备参考文献[8-9]。分别取0.7 g SiO2球、0.7 g小麦粉至三口瓶中，然后加入30 mL去离子水，超声混合30 min，在室温下搅拌8 h，接着在80 ℃中干燥24 h。之后在管式炉里面进行煅烧处理，在N2氛围下，以4 min/℃的升温速率加热到800 ℃，保持2 h，然后冷却至室温。用10%氢氯酸溶液除去SiO2模板，再用去离子水洗涤，60 ℃干燥12 h，即得到NDPC。

1.2.3 Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE传感器的制备

在干净的AuE电极表面进行氨基化处理，得到NH2-AuE。将10 μmol/L Apt与GNSs混合孵育3 h，然后滴加5 μL于电极表面，37 ℃下孵育2 h，得到Apt-GNSs/NH2-AuE传感器。

将10 mg/mL NDPC、50 μg/mL链霉亲和素(SA)、10 μmol/L生物素修饰的互补DNA(bio-cDNA)溶液混合在一起，37 ℃孵育2 h。然后加入10 mg/mL Th溶液孵育20 min。将Apt-GNSs/NH2-AuE电极浸泡其中，37 ℃下孵育90 min，得到Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE传感器。

1.2.4 Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE传感器对OTA的检测

利用差分脉冲伏安法(DPV)测定Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE传感器孵育OTA前后的峰电流。当OTA不存在时，大量Th-NDPC-cDNA通过与Apt杂交，固定在电极表面，Th产生一个高的初始峰电流。加入OTA后，由于OTA与Apt之间的亲和力高于Apt与cDNA之间的亲和力，因此Th-NDPC-cDNA从电极表面解离，电极表面的Th量减少，峰值电流降低。根据加入OTA前后电流信号的变化，可以实现对OTA的检测。

1.2.5 实际样品检测

取1 g研磨的玉米粉加入不同浓度的OTA，然后与5 mL萃取溶剂(甲醇与水体积比为6∶ 4 )混合，置于振荡器振荡30 min后再将萃取体系以8 000 r/min离心10 min，用0.45 μm滤膜过滤上清液后，使用50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)将滤液稀释100倍。根据上述预处理方法，分别制备0.01、0.10 、1.00 ng/mL的OTA加标玉米粉样品提取液。用Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE传感器对加标玉米样品进行检测，并进行回收率分析。

2 结果与讨论

2.1 试验原理

如图1所示，巯基修饰的Apt通过Au—S键固定在GNSs修饰的AuE表面，并滴加BSA封闭电极表面非特异性位点。NDPC与SA混合形成NDPC-SA，bio-cDNA通过SA-bio特异性结合，形成NDPC-cDNA。利用NDPC的多孔结构吸附Th，得到Th-NDPC-cDNA。Apt和cDNA杂交，可得到Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE。当OTA不存在时，Th-NDPC-cDNA被固定在电极表面，得到较大的电流a；当OTA存在时，OTA与Apt特异性结合形成OTA-Apt复合物，Apt的构象发生改变，导致Th-NDPC-cDNA脱落，电极表面固载的Th分子减少，此时得到较小的电流b。

图1 Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE的制备及其对OTA的检测原理

2.2 GNSs和NDPC的形貌表征

由图2a和图2b可知，制备的GNSs的颗粒直径为70～100 nm，分布均匀且具有明显的三维分支结构。由图2c可知，SiO2球的粒径约为200 nm，具有良好的单分散性。由图2d可知，除去SiO2之后的NDPC表面由多孔蜂窝结构的空心半球组成，平均直径为200 nm。

注：a.GNSs的扫描电镜图； b.GNSs的透射电镜图； c.SiO2的扫描电镜图； d.NDPC的透射电镜图。

2.3 Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE传感器的电化学表征

不同修饰电极在5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-(含KCl 0.1 mol/L)溶液中的电化学阻抗(EIS)见图3。由图3可知，裸电极AuE(a)的阻抗(Rct)为63.97 Ω。将氨基固定在AuE表面以获得NH2-AuE(b)后，Rct增加到92.32 Ω。将Apt-GNSs组装在NH2-AuE(c)上时，由于带负电的GNSs和Apt的磷酸骨架阻止了[Fe(CN)6]3-/4-到达电极表面，因此Rct增加到145.3 Ω。为了封闭电极上的非特异位点，将BSA滴加在Apt-GNSs/NH2-AuE上，Rct进一步增加到705.1 Ω(d)。当Th-NDPC-cDNA固定在Apt-GNSs/NH2-AuE上后，Rct明显降至210.9 Ω(e)，这是由于带正电的Th和具有良好导电性的NDPC协同促进了电极表面的电子转移。在OTA存在的情况下，由于OTA与Apt之间的亲和力较高，Th-NDPC-cDNA从AuE表面释放，从而使Rct增加至311.4 Ω(f)。

注：a.AuE； b.NH2-AuE； c.Apt-GNSs/NH2-AuE；d.BSA/Apt-GNSs/NH2-AuE； e.Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE； f.OTA/Th -NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE。

2.4 Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE传感器对OTA的检测

从图4可知，当OTA不存在时，大量Th-NDPC-cDNA通过与Apt杂交，固定在电极表面，峰电流为23.57 μA。加入0.5 ng/mL OTA后，由于OTA与Apt之间的亲和力高于Apt与cDNA之间的，Th-NDPC-cDNA从电极表面解离，峰电流降低至6.25 μA，减小了17.32 μA。根据加入OTA前后电流信号的变化，可以实现对OTA的检测。

图4 Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE在50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)中的差分脉冲

2.5 Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE传感器的优化

研究不同浓度Apt对Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE传感器性能的影响，结果如图5a所示。当OTA质量浓度为0.5 ng/mL时，Apt浓度在0.5～1.5 μmol/L范围内，ΔI呈上升趋势，这是由于随着Apt浓度的增加，Apt的固载量也在增加，ΔI持续增大。当Apt浓度超过1.5 μmol/L时，ΔI减小，这是由于过量的Apt会阻碍电极表面的电子转移。故而Apt的最佳浓度为1.5 μmol/L。

由于NDPC的浓度会影响cDNA和信号探针Th的固载量，从而影响所制备传感器Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE的检测信号，因此对NDPC的浓度进行优化。如图5b所示，当OTA质量浓度为0.5 ng/mL时，随着NDPC质量浓度增大至4 mg/mL，cDNA和Th的固载量增加，ΔI持续增大。当NDPC质量浓度继续增大时，ΔI呈下降趋势，这是由于多余的NDPC可能会堆叠在传感器表面，影响了OTA与Apt的结合。因此，选择NDPC的最佳质量浓度为4 mg/mL。

图5 不同浓度Apt和NDPC对Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE传感器的影响

2.6 标准曲线的建立

图6为OTA质量浓度在0～5 ng/mL范围内对应的微分脉冲伏安法(DPV)曲线，随着OTA质量浓度的增加，峰值电流不断减小。从图7可知，OTA质量浓度在0.001～5.000 ng/mL范围内，ΔI与lgCOTA之间呈线性关系，线性方程为ΔI=2.86lgCOTA+18.24 (R2=0.992)。该传感器的检出限为0.22 pg/mL (S/N=3)，与其他文献的检出限比较如表1所示。由表1可以看出，制备的传感器具有较宽的线性范围和较低的检出限，这是因为电极表面修饰的GNSs比表面积大、生物相容性好、导电能力强，可以加速电极表面的电子转移，实现信号放大。而具有大比表面积、良好生物相容性的NDPC，可以提高cDNA和Th的固载量，起到二次信号放大的作用。

图6 Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE传感器对OTA在0～5 ng/mL范围内的DPV曲线

图7 ΔI与lgCOTA的线性关系

表1 不同方法检测OTA的结果比较

2.7 实际样品检测

利用制备的传感器对玉米样品进行加标检测，结果如表2所示。玉米样品的平均回收率为89%～104%，说明该传感器可检测实际样品中的OTA。

表2 玉米样品中OTA的检测 (n=3)

3 结论

利用GNSs比表面积大、导电能力强的优点，将其作为电极修饰材料，达到加速电极表面的电子转移的目的，实现信号放大。利用NDPC比表面积大和生物相容性良好的特点，将其作为载体固定cDNA和电化学信号探针Th，起到二次信号放大的作用。制备的新型Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE，实现了OTA的高灵敏检测。本研究可用于基于核酸适配体的其他目标物的检测，为食品安全检测提供了技术支撑。