火龙果汁凉茶的制备及抗氧化分析

林大成，万一来，陈 静,2，王宇峰，莫 萍

1.北部湾大学 食品工程学院，广西 钦州 535011

2.北部湾大学 北部湾特色海产品资源开发与高值化利用重点实验室，广西 钦州 535011

3.北部湾大学 钦州市特色果蔬发酵重点实验室，广西 钦州 535011

4.广西灵山县宇峰保健食品有限公司，广西 灵山 535400

火龙果(Hylocereuspolyrhizus)又称红龙果、仙人果、仙蜜果及龙珠果等[1]，其果肉营养丰富，甜菜苷与甜菜红素含量高，还含有单元不饱和脂肪酸(油酸、棕榈油酸、顺-11-十八碳烯酸)、多元不饱和脂肪酸(亚油酸、亚麻酸)及多酚物质，具有抗氧化、降血脂、降血糖等生理生化活性[2-3]。火龙果是凉性水果，高纤维、低脂、低糖并含有一般水果少有的植物蛋白，适合做凉茶饮料，是夏日运动补给营养的最佳健康饮品。目前对火龙果复合饮料的研究较多，如玫瑰、圣女果、绿茶、菠萝、柑橘、苹果、蜜茶等火龙果饮料[1,4-10]。也有在火龙果汁中添加活性菌或酸奶发酵的研究[11-13],该产品具有双重营养保健功效。

现代保健养生概念盛行，兼具药食同源的中药草本植物有望成为饮料界的新兴应用原料。一般凉茶在制作工艺中，都加入菊花、金银花、罗汉果、决明子、甘草、薄荷、夏枯草、蒲公英及淡竹叶等中药草本植物，具有保健养生的功效。兼具口感、营养与保健养生的火龙果汁凉茶饮料很少见，其所含的甜菜色素与抗氧化保健功能的量效关系亦少有探讨，因此开发保健型火龙果汁凉茶饮料具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

火龙果、柠檬：广西钦州；仙草：广西灵山县宇峰保健食品有限公司；中药(山药、枸杞、红曲)：西安百庆生物科技有限公司；优质白砂糖、混合乳酸菌种(嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌)：山东菌乐生物科技有限公司；MRS培养基：杭州百思生物技术有限公司。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、铁氰化钾、亚油酸、硫酸氰氨、菲洛嗪(Ferrozine)、Folin-Ciocalteu、乙二胺四乙酸(Sigma)：西安热默尔生物科技有限公司；乙醇、抗坏血酸、苯酚、葡萄糖、三氯乙酸、三氯化铁、氯化亚铁、磷酸盐缓冲液(pH 6.6、pH 7.4)等：分析纯，广州柏研生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

TG16 MW台式高速离心机：湖南赫西仪器装备有限公司；Evolution 201 & 220紫外-可见光分光光度计：上海谱祥科学仪器有限公司；YH-200DH超声波振荡器：上海予皓科学仪器有限公司； AE300 L-H台式高速均质机: 深圳市良谊实验室仪器有限公司；BPH-9272恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；KTNK-80冷冻干燥机：上海乔枫实业有限公司。

1.3 火龙果汁凉茶加工工艺

原料(火龙果、柠檬)→榨汁→配料(仙草汁、中药浓缩液、糖)→纯水混匀→巴氏灭菌→冷却→接种乳酸菌→42 ℃、24 h发酵培养→均质→离心→过滤→巴氏灭菌→封罐→成品。

1.4 试验设计

以MRS培养基添加经蒸煮提炼的中药浓缩液1%(m山药∶m枸杞∶m红曲=1∶ 1∶ 1)，培养混合乳酸菌(1%，m嗜酸乳杆菌∶m德氏乳杆菌保加利亚亚种∶m嗜热链球菌=1∶ 1∶ 1)作为试验组(EX)，同时以仅添加乳酸菌发酵为控制组(CL), 仅添加中药为对照组(CK)及纯火龙果汁为空白组(BK)进行抗氧化功能评估，并测定总酚与甜菜苷色素含量，分析抗氧化的保健机理及量效关系。仙草汁与中药浓缩液的制备方法为各取5 g样品加蒸馏水300 mL，蒸煮至150 mL后过滤备用。

1.5 单因素试验与正交试验

单因素试验主要考察糖添加量(10%、12%、14%、16%、18%)、中药浓缩液添加量(1%、2%、3%、4%、5%)、菌种添加量(4%、6%、8%、10%、12%)及柠檬汁添加量(6%、7%、8%、9%、10%)对火龙果汁凉茶感官评价的影响，其中火龙果汁体积占凉茶体积的20%，以保证果汁的发酵质量。在单因素试验的基础上进行四因素三水平的正交试验，确定优化配方。当选取某个因素进行单因素试验时,其他因素条件固定选择第3个水平。

1.6 感官评价标准

火龙果汁凉茶的感官评价标准参考文献[8]并稍加修改，见表1。由30名食品专业的学生担任感官评价员，分3组对不同处理的样品进行感官评定。

表1 火龙果汁凉茶感官评价标准

1.7 抗氧化功能试验

抗氧化功能评估采用DPPH清除能力、还原力、亚铁离子螯合作用及亚油酸过氧化抑制作用等指标, 测定方法参考文献[14-15]并稍加修改，其中阳性对照组(positive control, PC)：亚铁离子螯合作用为EDTA，其余3项为VC。总酚含量(total phenolic content, TPC)测定采用 Folin-Ciocalteu法, 以没食子酸为阳性对照, 参考文献[16]的方法。各试验样品质量浓度为10 mg/mL。

1.8 甜菜苷的提取与测定

采用超声波水提法提取火龙果汁凉茶中甜菜苷色素，其含量用摩尔消光系数法测定，参考文献[17]并稍加修改。首先称取一定量的火龙果汁凉茶饮料置于离心管中，用超声波振荡器振荡20 min，以10 000 r/min离心10 min提取红色素。再以RO水稀释一定倍数，与蒸馏水进行对照，在535 nm波长下测定吸光度，计算红色素含量。

C=D(535)×MW×V×DF×100/(ε×L×W),

式中：C为待测样品中甜菜苷红色素质量浓度，g/L；DF为稀释倍数；MW为标准甜菜苷摩尔质量，550.46 g/mol；V为样品溶液体积，mL；L为试管的透光路径长度，cm；W为新鲜原料的质量，g；ε为标准甜菜苷摩尔消光系数，61 600 L·cm-1·mol-1。

1.9 理化指标的测定

总糖的测定参照GB/T 15672—2009；总酸的测定参照GB/T 12456—2008。

1.10 微生物指标的测定

菌落总数的测定参照GB 4789.2—2010；大肠杆菌的测定参照GB 4789.3—2010。

1.11 数据统计与分析

所有试验数据均为3次重复试验的平均值。抗氧化功能指标之间的比较采用Duncan多重比较。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

4个单因素对火龙果汁凉茶感官评分的影响见表2。

表2 单因素对火龙果汁凉茶感官评分的影响

2.1.1 糖添加量对火龙果汁凉茶感官评分的影响

由表2可知，随着糖添加量的增加，火龙果汁凉茶的感官评分先上升后下降。糖添加量的变化主要影响乳酸菌的生长与发酵作用，产生的胞外多糖具有乳化稳定溶液的效果，可以改善凉茶的口感和质地[18]。当糖添加量为14%时，感官评分最高为88.5±2.2，与10%和18%时的感官评分具有显著差异，此时产品酸甜适中，口感良好。

2.1.2 中药浓缩液添加量对火龙果汁凉茶感官评分的影响

由表2可知，中药浓缩液添加量1%～3%时，火龙果汁凉茶的感官评分逐步上升，至4%时感官评分则陡然下降。中药成分浓度不高时，凉茶口感尚可，风味也行；当中药浓缩液添加量超过4%时，凉茶稍有苦味，风味也不佳，可能是中药本草过量的单宁、黄酮等苦涩物质所致[19]。故最适中药浓缩液添加量为3%，此时感官评分最高87.4±2.8，与其他添加量的评分具有显著差异。

2.1.3 菌种添加量对火龙果汁凉茶感官评分的影响

由表2可知，火龙果汁凉茶的感官评分随菌种添加量的增加先增加而后降低。菌种添加量较少时，发酵不充分，口感不佳，风味也不足。在一定发酵时间，随着菌种添加量的增加发酵更充分，风味也浓郁，但过量时会造成发酵过度，菌体过量繁殖导致酸度过高，凉茶稳定性稍差，有沉淀混浊现象，可能是过量菌体与发酵底物黏稠度增加所致[12,20-21]。故最适菌种添加量为10%，此时感官评分最高88.5±2.7，与其他添加量的评分具有显著差异。

2.1.4 柠檬汁添加量对火龙果汁凉茶感官评分的影响

由表2可知，随着柠檬汁添加量的增加，火龙果汁凉茶的感官评分先上升后下降。柠檬汁的添加提供酸性环境促进乳酸菌的活性[22]，使火龙果汁凉茶具有良好的发酵特征风味。当柠檬汁添加量达7%时，感官评分最高86.5±2.1，与其他添加量的感官评分具有显著差异，此时凉茶酸甜比例适中(糖酸比2∶ 1)、pH(4.2±0.2)，与文献[3]相当，口感效果最佳，火龙果果肉中甜菜苷色素的稳定性也佳[23]。柠檬汁添加量多会导致过酸，将组织成分析出而致混浊分层，造成透光率降低从而影响澄清度[5]，口感也不佳。

2.2 正交优化试验

根据单因素试验结果进行L9(34)正交优化试验，因素与水平见表3，试验结果见表4。各因素对火龙果汁凉茶感官评分影响的主次顺序为B>C>A>D，最优组合为A2B3C2D2，即糖添加量14%、中药浓缩液添加量3%、菌种添加量10%、柠檬汁添加量7%。该组合不在正交试验表中，故进行验证试验，结果该组合的产品感官评分为93.5±1.1，高于正交试验中试验6的产品评分，说明正交试验结果准确可行。最佳糖酸比为2∶ 1，可强化果汁凉茶的口感，与刘雅[9]研究的糖添加量15%的效果相当；也与吴德智等[1]研究的糖酸比1.8∶ 1相近；另外本草中药对乳酸菌发酵的影响最大，因其富含多糖、氨基酸及矿物质等多种活性成分，可产生一定的促进作用与凉茶特征风味[24-25]。另外一般中药成分多含有单宁酸，可抑制病毒的蛋白酶活性，对抑菌也有一定的功效，可提高机体免疫力和保健效果[14,26]。

表3 正交试验因素与水平

表4 正交试验结果

2.3 方差分析

方差分析见表5，在不考虑交互作用的情况下，糖添加量、中药浓缩液添加量、菌种添加量及柠檬汁添加量对火龙果汁凉茶的感官评分都有极显著影响(P<0.01)，其中再次验证中药浓缩液添加量对产品的感官品质影响最大。故火龙果汁凉茶的最佳组合为A2B3C2D2，即糖添加量14%、中药浓缩液添加量3%、菌种添加量10%、柠檬汁添加量7%。

表5 方差分析

2.4 抗氧化评价

2.4.1 DPPH自由基清除能力

DPPH 自由基清除能力可作为抗氧化剂的强弱指标, 是维持人体内自由基平衡的重要因素之一[14-15]。如图 1所示，各组DPPH自由基清除能力强弱顺序为试验组(EX)、控制组(CL)、对照组(CK)、空白组(BK)，对DPPH自由基清除率分别为(88.4±1.8)%、(77.5±2.1)%、(71.8±2.4)%、(66.8±2.2)%， EX的效果是CL的1.1～1.2倍, 是CK的1.2～1.3倍, 是BK的1.3～1.4倍, 可知试验组显著优于各组，说明试验组对DPPH 自由基清除能力有促进作用。据研究报道，火龙果中主要的抗氧化成分是甜菜色素和酚类物质，而中药浓缩液中的红曲成分可以促进乳酸菌生化反应的酶系统，产生胞外多糖具有乳化作用，可稳定甜菜苷色素增加酚类物质，同时中药活性物质刺激乳酸菌生化反应使蛋白结合酚(protein-polyphenol complexes, PPC)分解释出游离酚，提高总酚含量从而提升其清除自由基的抗氧化功能[18,27]。因此，乳酸菌外源酶的生化作用促进火龙果与仙草内存的结合型多酚释出，转为自由型多酚从而增加抗氧化力；另外乳酸菌内源酶的生化作用不断产生动态的胞外多糖，也比中药存在的静态多糖多从而提高抗氧化力[28]，此二者都使得添加乳酸菌的控制组对DPPH 自由基清除能力优于对照组。

2.4.2 还原力

还原力(RP)可作为抗氧化剂能力的评估指标之一。如图1所示，各组还原能力的强弱顺序为试验组、控制组、对照组、空白组，其还原力分别为0.86±0.05、0.74±0.03、0.63±0.02、0.55±0.04，试验组的效果是控制组的1.1～1.3倍, 是对照组的1.2～1.5倍, 是空白组的1.4～1.8倍, 可知试验组显著优于其他组，说明试验组含有的中草药对还原力有促进作用。据研究报道中药浓缩液中的红曲发酵后可产生辅酶Q10，是细胞代谢与细胞呼吸的激活剂，可以促进乳酸菌生化反应的酶系统，可显著提高样品的还原力，使其具有抗氧化功能和效果[19,25,29]。

2.4.3 亚铁离子螯合作用

亚铁离子螯合作用(FC)也可作为抗氧化剂能力的评估指标之一，因为过渡金属在脂质氧化过程中具有催化作用。由于亚铁在过渡金属中具有相当高的反应活性，因此成为最重要的脂类氧化促进剂，所以对亚铁离子的螯合作用是一种抗氧化机制的体现[15]。如图1所示，各组对亚铁离子的螯合能力强弱顺序为试验组、控制组、对照组、空白组，对亚铁离子的螯合能力分别为(73.7±2.3)%、(68.6±2.6)%、(63.5±2.4)%、(58.1±2.5)%，试验组的效果是控制组的1.1～1.2倍, 是对照组的1.2～1.3倍, 是空白组的1.3～1.5倍, 可知试验组显著优于其他组，说明试验组含有的中草药对亚铁离子螯合能力有促进作用。据研究报道，中药浓缩液中山药含有的胶原蛋白多糖物质具有乳化效果，可稳定火龙果中甜菜色素物质与甜菜苷成分，并激活抗氧化防御系统，发挥抗氧化作用[2,26,30]。

注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.4.4 亚油酸过氧化的抑制作用

如图1所示，各组对亚油酸过氧化的抑制作用(AOA)能力强弱顺序为试验组、控制组、对照组、空白组，对亚油酸过氧化的抑制能力分别为(54.5±3.4)%、(48.6±2.2)%、(42.8±2.1)%、(35.4±2.8)%，试验组的效果是控制组的1.1～1.3倍, 是对照组的1.2～1.5, 是空白组的1.4～1.9倍, 可知试验组显著优于其他组，说明试验组含有的中草药对亚油酸过氧化的抑制能力有促进作用。据研究报道，中药浓缩液中的枸杞富含多糖物质，可与乳酸菌的胞外多糖共同作用，增强乳化性，稳定仙草或中药本草中的酚类物质，提供电子形成稳定的自由基中间体，从而提高抗氧化功能[2,19,24]。

2.4.5 总酚含量

总酚(TPC)是抗氧化剂的重要成分之一[14,18]。酚类抗氧化剂的一个重要的机制是将Fe(III)离子以螯合方式稳定成还原态的Fe(II) 离子，阻止油脂过氧化，因此，Fe(III)离子的还原作用常被作为提供电子的活性剂，与其他抗氧化剂性质密切相关[24]。如图1所示，各组总酚含量由大到小为试验组、控制组、对照组、空白组，分别为(29.6±0.5)、(25.3±0.6)、(22.7±0.8)、(16.5±0.7) mg/g，试验组的总酚含量是控制组的1.1～1.2倍, 是对照组的1.2～1.4倍, 是空白组的1.7～1.9倍, 可知试验组显著优于其他组，说明试验组中的中草药对总酚的生成有促进作用。据研究报道中药浓缩液中的红曲可促进乳酸菌发酵提升总酚含量，从而增进抗氧化功能[24,29]。由于总酚含量与胞外多糖及抗氧化活性呈正相关[18,24]，因此，总酚含量高说明火龙果汁凉茶饮料具有高的抗氧化活性。

2.5 甜菜苷色素和总多酚含量与抗氧化活性的关系分析

火龙果中主要的抗氧化成分是甜菜色素和酚类物质，其中甜菜苷(Betanin, BN)可有效地清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基，且清除效果与甜菜苷的含量呈正相关[2,17]。如表6所示，各组的甜菜苷色素含量分别为(78.5±1.4)、(65.3±1.8)、(57.4±1.5)、(48.7±1.6)mg/L，其与总酚含量、对抗氧化能力指标强弱顺序均为试验组、控制组、对照组、空白组，并均具有显著性差异(P<0.05)；甜菜苷色素、总酚含量及4种抗氧化指标的趋势线皆符合量效关系，R2都在0.962 4～0.999 8范围内，显示中药浓缩液可能含有某些生物活性因子以激发乳酸菌发酵的酶类生化反应系统，促进多糖产量增加，从而稳定并提升甜菜苷色素含量以增强抗氧化活性，此与文献[17,26]研究的量效关系一致。利用中药浓缩液促进微生物发酵作用, 同时也表现抗氧化活性的加成作用，可大幅增强保健效果[1,16,19]。甜菜苷色素表现的抗氧化活性机理与含有邻苯二酚基团的色素成分有关，酚基团是良好的电子供体，是其发挥抗氧化作用的关键所在[2,26]。故经中药优化的火龙果汁凉茶具有高抗氧化保健效果。

表6 各组的甜菜苷色素和总酚含量与抗氧化活性的关系

2.6 质量评价

2.6.1 感官指标

组织状态：质地均匀细腻，无沉淀分层现象。口感滋味： 口感清新，酸甜爽口。发酵风味： 发酵特征纯正，果香清醇。外观色泽： 色泽均匀，晶莹清澈。

2.6.2 理化指标

总糖含量：(14.1±1.2)%；总酸(以醋酸计)：(1.32±0.11) mg/dL；pH(4.2±0.2)。

2.6.3 微生物指标

菌落总数：9 CFU/mL(<100 CFU/mL)；大肠菌群:1个(<3个(MPN/100 mL))；致病菌：未检出。

3 结论

利用中药促进乳酸菌发酵火龙果汁与仙草汁，创新开发保健型火龙果汁凉茶饮料，使其具备活性乳酸菌发酵的仙草多糖与火龙果营养、兼具中药促进抗氧化和保健养生等复合功能。最佳工艺和配方组合：糖添加量14%、中药添加量3%、菌种添加量10%、柠檬汁添加量7%。该产品的DPPH自由基清除率(88.40±1.80)%、还原力(0.86±0.05)、亚铁离子螯合力(73.7±2.3)%、亚油酸过氧化抑制作用(54.5±3.4)%、甜菜苷色素含量(78.5±1.4) mg/L、总酚含量(29.6±0.5) mg/g，说明火龙果汁凉茶饮料具有较高的抗氧化功能。中药可促进乳酸菌发酵使火龙果汁凉茶饮料具有较好的保健效果，且火龙果甜菜苷色素和总酚含量与DPPH等抗氧化指标具有正向的量效关系，故本研究开发的火龙果汁凉茶饮料可适应现代休闲保健饮品的养生需求。