淀粉粒径对小麦淀粉-月桂酸复合物结构及消化性的影响

褚绍言，孙冰华，马 森，王晓曦

河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001

淀粉是谷物类食品中最重要的碳水化合物，由直链淀粉和支链淀粉以相互缠结的有序排列的半结晶颗粒存在。淀粉中直链淀粉分子链或支链淀粉的侧链可通过内部氢键和疏水相互作用使其呈现内疏水外亲水的螺旋构象，内部的疏水空腔可与脂质形成复合物[1]。研究表明，淀粉-脂质复合物可通过抑制淀粉颗粒的吸水膨胀来阻碍酶进入其颗粒内部，降低淀粉在消化过程中对淀粉酶的敏感性，从而提高慢消化淀粉和抗性淀粉含量[2]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金苑特一粉：郑州金苑面业有限公司；月桂酸：阿拉丁试剂(上海)有限公司；直链淀粉/支链淀粉试剂盒：爱尔兰Megazyme公司；猪胰α-淀粉酶(A3176-500KU)：美国Sigma公司；淀粉葡萄糖苷酶(3 260 U/mL)：爱尔兰Megazyme公司。其他化学品均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BT-9300S激光粒度分布仪：丹东市百特仪器有限公司；Co.S-3400NII扫描电镜：日本HITACHI公司；52i偏光显微镜：日本尼康公司；Q20差示扫描量热仪：美国TA公司；D8 Advance X-射线衍射仪：德国Bruker公司；Nicolet 6700红外光谱仪：赛默飞世尔科技公司。

1.3 方法

1.3.1 小麦淀粉的制备

参照张玉荣等[13]的方法制备小麦淀粉。将面粉和水(质量比1∶ 2)用和面机揉成面团，室温下静置20 min。用足量的蒸馏水揉洗面团，并将淀粉浆过100目筛。静置6 h后，弃去上清液，将余下的淀粉浆离心(3 500g，15 min)，弃去上清液，刮下上层黄色蛋白质，收集下层物质。用无水乙醇进行洗涤抽滤，将得到的淀粉于40 ℃烘箱内干燥后研磨，过100目筛，保存于自封袋中备用。

1.3.2 不同粒径小麦淀粉的分级

参照Chen等[14]的方法并稍加修改，采用Stokes沉降法将原小麦淀粉进行颗粒分级。称取20.00 g小麦淀粉装入量筒中，加蒸馏水至1 L，密封后反复摇晃至均匀。静置41.6 min后，利用虹吸装置将最上层200 mL的分散液移至烧杯中，然后补足蒸馏水至1 L，重复上述操作至上层200 mL溶液澄清为止，所收集的分散液为小颗粒淀粉(WS-S)。继续重复上述步骤，静置10.4 min，分离出中颗粒淀粉(WS-M)，剩余部分则为大颗粒淀粉(WS-L)。将上述分散液离心(3 500g，10 min)、干燥(40 ℃，12 h)后研磨，过100目筛，保存于自封袋中备用。沉降公式如下。

式中：t为小麦淀粉颗粒沉降所需要的时间,s；η为水的黏度(1.003×10-3Pa·s)；h为沉降高度，m；ρs和ρw分别为淀粉和水的密度(1 500、998.23 kg/m3)；D为淀粉颗粒直径，m。

1.3.3 小麦淀粉的粒径大小及分布测定

将上述分级后的小麦淀粉分散于蒸馏水中得到一定浓度的淀粉分散液，使用激光粒度分布仪对其进行分析。样品折射率为1.53，遮光率为5%～10%。

1.3.4 小麦淀粉的直链淀粉含量测定

使用Megazyme直/支链淀粉检测试剂盒测定直链淀粉含量。

1.3.5 小麦淀粉的颗粒形貌观察

取约0.05 g淀粉样品，加入0.5 mL蒸馏水，制成淀粉混合液。将混合液滴加至载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜下观察淀粉的颗粒形貌与偏光十字。用导电胶将淀粉颗粒固定在样品台上进行喷金处理，采用扫描电子显微镜观察淀粉颗粒微观结构，加速电压10 kV。

1.3.6 淀粉-月桂酸复合物的制备

参照常丰丹[7]的方法并稍加修改。分别称取2.00 g小麦淀粉与蒸馏水混合，配制成10%(m/m)的淀粉悬液，45 ℃恒温水浴振荡30 min使淀粉膨胀。将溶于无水乙醇中的月桂酸(10%，m/m，以淀粉计)加入膨胀的淀粉乳中，恒温水浴振荡90 min进行复合。然后将复合溶液离心(3 500g，15 min)，并用50%乙醇洗涤沉淀物，重复上述操作数次直到上清液澄清，将沉淀物置于烘箱中，40 ℃干燥12 h，研磨过100目筛。

1.3.7 络合指数的测定

参考Wang等[15]的方法，将0.4 g复合物放入50 mL离心管中，加入蒸馏水，总质量为5 g。旋涡混合后，沸水浴加热10 min至完全糊化。冷却至室温后，加入25 mL蒸馏水，旋涡混合2 min后离心(3 000g，15 min)。取上层清液500 μL，加入15 mL蒸馏水和2 mL碘液(2.0% KI和1.3% I2)于620 nm测定吸光度。络合指数(CI)计算公式如下：

CI=(OD0-OD)/OD0×100%，

式中：OD0为原淀粉的吸光度；OD为复合物的吸光度。

1.3.8 热特性分析

采用差示扫描量热仪(DSC)对样品的热特性进行测定。准确称取2.5 mg样品(干基)于铝制高压盘中。按照样品与水质量比1∶ 3加入蒸馏水，密封后在室温下平衡24 h。测试条件：温度从30 ℃升至120 ℃，升温速率为5 ℃/min，以空盘为对照。

1.3.9 结晶结构分析

样品的晶型结构可使用X-射线衍射仪测定。测试条件：Cu钯，管压40 kV，管流40 mA，步长0.02°，扫描速率为10°/min，2θ为5°～40°。使用软件Jade 6.0计算样品的相对结晶度。

1.3.10 短程有序性分析

将淀粉与干燥后的溴化钾混合物(质量比1∶ 100)置于玛瑙研钵中研磨，压片后，进行红外光谱扫描。扫描波数400～4 000 cm-1，分辨率8 cm-1，扫描次数32次。通过OMNIC 8.2软件进行傅里叶去卷积处理，设置参数为峰宽19 cm-1，增强因子1.9 cm-1。

1.3.11 体外消化性测定

参照Englyst等[16]的方法并稍加修改。将200 mg样品与15 mL醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 5.2，0.1 mol/L)混合均匀，置于37 ℃水浴中预热10 min。然后加入5 mL酶液(290 U/mL猪胰α-淀粉酶和15 U/mL的淀粉葡萄糖苷酶)，于37 ℃恒温水浴中(300 r/min)孵育培养2 h，每隔20 min从中吸取0.5 mL的酶解液于沸水浴中灭活后，离心(10 000g，5 min)。用3.5-二硝基水杨酸(DNS)法分析葡萄糖含量。快消化性淀粉(RDS)、慢消化性淀粉(SDS)、抗性淀粉(RS)含量计算公式如下：

wRDS=(G20-G0)×0.9/m×100%,

wSDS=(G120-G20)×0.9/m×100%,

wRS=1-wRDS-wSDS，

经过单次循环后，为本次循环返程路径上信息素的迹增量，其值等于符合式（1）的蚂蚁A（组团A）留在该路径上的信息素的迹浓度，即，其中：为符合式（1）的蚂蚁（组团）个数；表示第只蚂蚁在本次循环中留在路径上的信息素的迹浓度，为常量，表示第只蚂蚁经过路径的距离．

式中：G0为酶解前的葡萄糖质量,mg；G20为酶解20 min时葡萄糖质量,mg；G120为酶解120 min时葡萄糖质量,mg;m为总淀粉质量,mg。

为了更好地理解淀粉的体外消化曲线，Goni等[17]提出淀粉类食品体外消化性符合一阶动力学公式：

Ct=C∞(1-e-kt)，

式中：Ct为时间t时消化的淀粉量;C∞为消化时间无限长时对淀粉消化的一个评估量;k为淀粉消化速率系数。对一阶动力学方程进行对数-斜率处理得到转换方程：

式中：ln(dCt/dt)表示斜率的对数，方程描述了ln(dCt/dt)与淀粉酶解时间t的线性关系。

1.4 数据处理

采用SPSS Statistics 20对实验数据进行统计分析，用单因素方差分析法(ANOVA)检验，显著性水平为P<0.05。采用Origin 8.5分析数据并制图。

2 结果与讨论

2.1 小麦淀粉粒径分布及直链淀粉含量

表1 小麦淀粉粒径分布及直链淀粉含量

2.2 不同粒径小麦淀粉颗粒形貌分析

为了进一步验证Stokes沉降法分离淀粉的有效性，使用扫描电镜和光学显微镜观察不同粒径小麦淀粉的颗粒形貌和偏光十字(图1)。由图1A1可以看出，原小麦淀粉由不同形状的淀粉粒组成，且颗粒大小范围很广。Stokes沉降法分离所得的3种粒径小麦淀粉颗粒的形状和大小都较为均一，其中WS-S(图1B1)颗粒形状多呈球形或多边形，且有团聚的现象，WS-M(图1C1)和WS-L(图1D1)颗粒呈扁豆状或盘状结构。淀粉颗粒在偏振光场下可以观察到偏光十字，不同粒径小麦淀粉的偏光十字明显程度不同，随着粒径的增加，双折射现象逐渐增强。

注：A1、A2和A3为WS；B1、B2和B3为WS-S；C1、C2和C3为WS-M；D1、D2和D3为WS-L。

2.3 粒径对淀粉-脂质复合物络合指数的影响

复合物的络合指数可通过碘与未复合的直链淀粉反应，间接体现出直链淀粉与脂质的复合程度[19]。从图2可以看出，不同粒径淀粉-脂质复合物的络合指数有显著性差异，粒径越大，络合指数越高。可能由以下几个方面原因引起：首先，大颗粒淀粉中直链淀粉含量较高，且更多的直链淀粉分子集中分布在颗粒的近表层区域。其次，大颗粒淀粉有更多的长侧链和较少的短侧链[20]。再次，大颗粒淀粉表面的小孔和通道非常明显，特别是在中环槽处，而小颗粒淀粉没有中环槽，其表面几乎没有可见孔洞[21]。因此，在复合反应时，大颗粒淀粉会微微膨胀，使表面的孔道打开，月桂酸进入孔道，与直链淀粉进行复合。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.4 粒径对淀粉-脂质复合物热特性的影响

不同粒径小麦淀粉及其复合物的DSC曲线如图3所示，热力学参数见表2。小麦淀粉-月桂酸复合物被检测到了两个吸热峰(图3b)，峰I是淀粉的糊化吸热峰，峰Ⅱ则为复合物的相变吸热峰。淀粉的糊化是颗粒中分子有序排列的瓦解，伴随着淀粉的一些特性发生不可逆的无序化转变[22]。在添加月桂酸后，复合物的起始糊化温度高于原淀粉，表明所形成的复合物可以抑制淀粉的糊化，这可能是由于复合物主要附着在淀粉颗粒表面，形成疏水层，延缓水分子进入颗粒内部区域，从而减缓颗粒吸水膨胀的速率[8]。从表2可以看出，不同粒径小麦淀粉-月桂酸复合物的焓随着粒径的增加而变大。Putseys等[23]研究表明焓可用来衡量复合物的形成量，焓越高说明形成的淀粉-脂质复合物越多。这进一步说明粒径越大，淀粉与月桂酸的复合程度越高。

表2 不同粒径小麦淀粉及其复合物热力学参数

图3 不同粒径小麦淀粉及其复合物DSC曲线

2.5 粒径对淀粉-脂质复合物结晶结构的影响

图4为不同粒径小麦淀粉及其复合物的X-射线衍射图谱。小麦淀粉在2θ为15°、23°处出现单峰，17°、18°处出现双峰，为A型淀粉结晶结构[24]。小麦淀粉-月桂酸复合物XRD图谱仍具有明显的衍射峰，说明与月桂酸复合后淀粉的内部结构几乎没有被破坏。此外，可以看出在2θ为20°出现强的衍射峰，这是由小麦淀粉-月桂酸复合物的形成引起的。脂质的疏水基团在直链淀粉的螺旋腔内参与了淀粉的重结晶，形成复合物独特的V型晶体结构[22]。对比不同粒径小麦淀粉-月桂酸复合物图谱可以看出，WS-S-LA在2θ为20°处的衍射峰较弱，而WS-L-LA的衍射峰则较强，说明形成的复合物更多。

图4 不同粒径小麦淀粉及其复合物X-射线衍射图谱

2.6 粒径对淀粉-脂质复合物短程有序性的影响

通常使用红外光谱中1 047/1 022 cm-1和1 022/995 cm-1处吸光度的比值表征淀粉的有序结构，1 047/1 022 cm-1处的比值越大，表明淀粉的短程有序性越好，1 022/995 cm-1处的比值越小，则表明淀粉的短程有序性越好[25]。由表3可以看出，不同粒径小麦淀粉的1 047/1 022 cm-1处吸收峰强度比值随着粒径的增大而增大，说明大颗粒淀粉的短程有序性更强，晶体结构更加均一、完美。与原淀粉相比，不同粒径小麦淀粉-月桂酸复合物的1 047/1 022 cm-1处吸收峰强度比值增大，表明形成的V型复合物促进了淀粉结构的短程有序性。这与Zheng等[26]的研究结果一致，脂质配体的加入能够有效调控淀粉分子之间的重排，促进淀粉单螺旋结构的形成，增强其短程有序性。

表3 不同粒径小麦淀粉及其复合物的相对结晶度和短程有序结构

2.7 粒径对复合物消化性的影响

根据不同粒径小麦淀粉及其复合物的体外消化数据所拟合的一阶动力学模型如图5所示。所有样品均表现出初始阶段消化速率快，约60 min后消化速率趋于平稳。小颗粒淀粉消化速率最快，大颗粒消化速率最慢，这一结果主要归因于淀粉颗粒越小比表面积越大，酶的作用位点越多，有利于酶的吸附和扩散。与原淀粉相比，对应复合物体外消化曲线均有不同程度的变化。WS-L-LA的消化速率呈降低趋势，WS-M-LA的消化速率和酶解程度与WS-M相似，而WS-S-LA的消化速率则变快。这一现象可能是因为小颗粒淀粉仅表面的直链淀粉与月桂酸发生复合，间接提高了其对酶的吸附性，增加酶的作用位点。而大颗粒淀粉与月桂酸复合物的生成量较高，使得颗粒有着更大的堆积密度，结构更为致密，不易被酶解。从一阶动力学方程中推导出的消化速率系数k见表4。k值反映了样品对酶水解的敏感性，k越大，消化速率越快。所有样品中WS-L-LA的消化速率系数最小，对淀粉酶的敏感性也就最低。

图5 不同粒径小麦淀粉及其复合物消化数据的一阶动力学模型和样品的消化速率系数

不同粒径小麦淀粉及其复合物的RDS、SDS和RS含量见表4。与原淀粉相比，WS-S-LA的RDS含量升高，WS-M-LA的RDS含量无明显变化，而WS-L-LA的RDS含量降低，RS含量升高，这一结果与消化曲线图和消化速率系数k相对应。因此，WS-L-LA对淀粉酶敏感性较低、消化速率较为缓慢，可作为慢消化性淀粉应用于食品加工等领域。

表4 不同粒径小麦淀粉及其复合物的消化特性和消化速率系数

3 结论

采用Stokes沉降法将小麦淀粉分为3种不同组分，在低于其糊化温度下制备不同粒径小麦淀粉-月桂酸复合物。大颗粒淀粉与月桂酸的复合程度最高，且复合物的焓随着粒径的增加而变大，XRD图谱在20°处形成了独特的V型晶体结构。复合物在1 047/1 022 cm-1处吸收峰强度比值相比于原淀粉明显增大，添加月桂酸使得小麦淀粉结晶区发生了分子重排，内部结晶结构更有序。与原淀粉相比，大颗粒淀粉-月桂酸复合物消化速率明显下降，有效降低了RDS含量，提高了RS含量。综上所述，淀粉粒径对小麦淀粉-月桂酸复合物的热特性、晶体结构、短程有序度产生一定的影响，进而影响其消化特性。