基于二阶校正方法的牛乳中沙门氏菌快速检测

陈 煜，邱智军，张 彬

（河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳 471003）

牛奶及其制品中含有丰富的营养物质，包括人体生长发育所需的各种必需氨基酸、非必需氨基酸、矿物质和维生素等，是目前普遍受消费者欢迎的滋补饮品[1-2]。但其在生产、加工及运输过程中易受到食源性病原微生物的污染，进入人体之后会引发一系列身体不适，严重威胁人体健康[3]。常见食源性致病菌有沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌等，一般通过摄食感染人体并在体内大量繁殖进而使人患上感染性疾病或者中毒性疾病[4-5]。而沙门氏菌是一种可以引发食物中毒的重要食源性病原菌，也是人畜共患病之一[6]，被感染者会引起食物中毒、胃肠炎、腹泻等疾病，且目前出现越来越多的耐药性现象，因此建立牛奶中沙门氏菌残留快速、高效检测方法尤为重要。

目前，关于沙门氏菌传统的检测方法主要有生物化学法，通过细菌培养，检测其在培养基中的代谢产物，通过判断细菌的分解代谢特征，进而达到细菌检测的目的，该方法成本低、准确度高，检测结果比较直观，且能够得到定性和定量的分析与结果，但检测周期较长，且操作比较繁琐，不能满足现场实时快速检测[7]。近年来，随着检测技术的革新，一些新的检测技术逐渐被开发出来，三维荧光检测技术以其灵敏度高、在线检测时间短、样品前处理简单等优点而被用于各种微生物的快速鉴别和表征[8-9]。三维荧光光谱仪的结构主要包括光源、激发单色器、样品池、发射单色器和检测器等。首先光源发出光经过激发单色器得到想要的激发波长，激发样品产生荧光，然后荧光经过发射单色器被检测器收集并变成相应的电信号，最后以光谱形式呈现出来[10]。

三维荧光光谱仪器见图1。

图1 三维荧光光谱仪器

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试剂

无菌牛奶，购自洛阳家乐福超市；LB液体培养基（胰蛋白胨2 g、酵母粉1 g、NaCl 2 g溶于200 mL蒸馏水，并采用高压蒸汽灭菌）；LB固体培养基（胰蛋白胨6 g、酵母粉3 g、NaCl 6 g、琼脂12 g溶于1 000 mL蒸馏水，并高压蒸汽灭菌）；生理盐水（NaCl 0.9 g溶于1 000 mL蒸馏水，并采用高压蒸汽灭菌）。

1.1.2 仪器及设备

ME204E型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司产品；QE-3型台式恒温振荡器，天津市欧诺仪器仪表有限公司产品；HYL-G型恒温振荡摇床，江苏太仓市强乐实验设备有限公司产品；Cary Eclipse型三维荧光光谱仪，安捷伦科技（中国）有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化及扩大培养[11]

使用灭菌的接种环挑取少量菌种接入含有50 mL的LB液体培养基的锥形瓶中，于37℃下以转速150 r/min振荡培养24 h，该步骤为菌种活化。用移液枪吸取50μL活化好的第一代菌悬液于含有50 mL的LB液体培养基的锥形瓶中，于37℃下以转速150 r/min振荡培养12 h，此步骤为菌种的扩大培养。

1.2.2 菌悬液的制备[12]

取第二代菌悬液4 mL于10 mL离心管中，25℃条件下，以转速5 000 r/min离心10 min，去除上清液，向沉淀中加4 mL生理盐水充分振荡，以转速5 000 r/min离心10 min，再次去除上清液并入加5 mL生理盐水悬浮混匀，制成菌悬液。

1.2.3 校正样和测试样确定

取1 mL离心后的菌悬液于含有9 mL牛奶的试管中，振荡摇晃使之混匀，制成1×10-1的稀释液，取1 mL 1×10-1的稀释液于含有9 mL牛奶的试管中，振荡摇晃使之混匀，制成1×10-2的稀释液，取1×10-1的稀释液7.5 mL于含有2.5 mL牛奶的试管中制成1×10-1×75%的稀释液，以相同方法制成1×10-1×50%，1×10-1×25%，1×10-2×75%，1×10-2×50%，1×10-2×25%的稀释液。试验检测用的8个样品（空白样品除外），其高浓度和低浓度区间跨度较大，且样品可能存在分布不均状态，人为操作也可存在误差，综合考虑选择1×10-2×100%和1×10-2×25%中间2个样品为测试样，选择其余样品为校正样。

1.2.4 试验参数设置

牛奶中成分比较复杂，其各干扰成分均能产生相应的荧光，试验选择激发波长范围为250~550 nm，发射波长范围为265~700 nm，间隔2 nm取一个数据，其中狭缝的宽度选择5.0/5.0 nm，扫描速度为2 400 nm/min[13]。

1.2.5 数据处理

牛奶体系中成分十分复杂，存在众多干扰因素，因而无法确定准确组分数，故试验使用ATLD算法的二阶校正方法进行计算，并利用交替最小二乘原理对多维数据进行解析。该方法在定量分析上速度快且准确度高。

（1）三线性成分模型。使用激发发射荧光光谱仪，在选定的i个激发波长，j个发射波长下对K个样品（包括校正样和测试样）进行扫描并将吸光度值收集在一个大小为i×j×M的三维数据阵X中，该三维数据阵中的每个元素xijk，用数学公式表示如下[14]：

式中：i=1，2，……i；j=1，2，……j；k=1，2，

……K；

xijk——立体阵X的元素（i，j，k），即第k个样本在第i个激发光波长和第j个发射波长下的荧光强度；

ain——相对激发光谱矩阵A（I×N）中的元素（i，n）；

bjn——相对发射光谱矩阵B（J×N）中的元素（j，n）；

ckn——相对浓度矩阵C（K×N）中的元素（k，n）；

eijk——残差阵E(I×J×K)中的元素（i，j，k）；

N——组分数，即对体系做出贡献的总的组分数，包括感兴趣的组分、背景和未校正的干扰等。

（2）ATLD算法。ATLD算法利用最小二乘原理，借助基于切尾奇异值分解（T-SVD）的Moore-Penrose广义逆计算进行三线性数据分解。令a(i)、b(j)、c(k)分别表示矩阵A、B、C中的第i、j、k行，则三维三线性矩阵可表示为[14]：

式中：a(i)、b(j)、c(k)可分别通过最小化损失函数得出，损失函数指的是残差矩阵元素的平方总和，函数如下[15]：

式中：||.||F2表示Frobenius矩阵范数，Xi..、X.j.、X..k分别是三维响应数阵X沿着激发光波波长、发射光波长及所测物质浓度方向的第i、j、k个切片。基于迭代计算步骤的ATLD二阶校正法以切片矩阵方式进行计算，迭代过程中，B和C作归一化处理[14]。

（3）品质因子。一般采用灵敏度（SNE）、选择性（SEL）、检出限（LOD）等指标来对方法的性能进行评估。SNE指的是单位浓度纯分析信号，SEL指的是灵敏度与总信号的比值，由公式（8）和（9）计算[16-17]，LOD[18]可以用3个背景空白样预测浓度的标准偏差的3倍表示。

式中：nm——矩阵中的（n，n）个元素；

*——Hadamard积；

k——单位浓度组分n的总信号，表示浓度得分参数。

2 结果与分析

2.1 牛奶中沙门氏菌的三维荧光光谱

牛奶中的沙门氏菌三维荧光光谱见图2，牛奶中沙门氏菌的等高线荧光光谱见图3。

由图2可以看出，沙门氏菌三维荧光光谱的发射光在波长550~675 nm范围内存在一个较宽的谱峰，其峰值为610 nm，且随着激发光强度的增强谱峰强度逐渐增强，特征峰显著。由图3可以看出，在波长455~535 nm范围内和波长390~530 nm范围内存在2个特征吸收峰，通过图谱分析发现其分别为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和甲醛脱氢酶（FADH），且2个特征吸收峰均产生红移现象。牛奶中沙门氏菌的三维荧光光谱和等高线荧光光谱均可作为沙门氏菌检测的依据，三维荧光光谱检测允许存在未知的各种干扰因素，可同时检测分析出多个样品的重叠光谱信号，从而用于快速、准确地检测出牛奶中沙门氏菌残留。

图2 牛奶中的沙门氏菌三维荧光光谱

图3 牛奶中沙门氏菌的等高线荧光光谱

2.2 牛奶中沙门氏菌的定量分析

采用ATLD算法对通过三维荧光扫描得到的三维数据进行解析[19]。

ATLD法与三维荧光结合测定牛奶中沙门氏菌（N=3）见表1。

表1 ATLD法与三维荧光结合测定牛奶中沙门氏菌（N=3）

当组分为2时，ATLD算法所得校正集中沙门氏菌的相对浓度与试剂浓度相关系数为0.996 1，预测样中沙门氏菌平均回收率为93.5%±2.3%。

ATLD算法获得品质因子数见表2。

表2 ATLD算法获得品质因子数

由表2可知，ATLD算法能较好地分辨出沙门氏菌所激发的荧光光谱，可实现对牛奶中沙门氏菌的直接快速定量检测，同时也进一步证明二阶校正法的“二阶优势”[20]。

3 结论

沙门氏菌是牛奶在生产、加工及运输过程中主要防治的病原微生物污染源。牛奶中含有丰富的营养物质，使得整个检测体系成分复杂，利用三维荧光光谱技术，结合基于ATLD的二阶校正算法，直接快速对牛奶中沙门氏菌进行定量分析。与常规的检测方法相比，该方法利用二阶校正的“二阶优势”，成功地解决了检测体系中复杂成分的干扰问题，实现牛奶中在干扰物共存下对沙门氏菌的快速检测。