紫色红曲霉MD10产蛋白酶条件优化及其部分酶学性质

戴纯纯，陈晓明

（淮阴工学院生命科学与食品工程学院，江苏淮安 223300）

蛋白酶是一类能有效催化蛋白质水解成蛋白胨、多肽和氨基酸的水解酶，已经被广泛应用于肉制品[1-2]、皮革[3]、水产品[4-5]、茶饮[6]等生产领域，其数量占全球酶制剂销售总量的60%左右[7]。蛋白酶既可以从动植物中获得，也可以从微生物中获得。宗红等人[8]通过硫酸铵盐析及凝胶层析法从米曲霉中分离纯化出蛋白酶，并对该米曲霉所产的蛋白酶的特性进行了探究，发现该蛋白酶对疏水性氨基酸表现出较强的选择性，这对于米曲霉在食品中的利用提供了一定的参考意义。王鑫等人[9]利用黑曲霉基因在毕赤酵母进行基因重组，并通过优化培养获得高活性的蛋白酶，提高了黑曲霉蛋白酶的pH值及热稳定性，为蛋白酶制剂工业提供了新的研究思路。郑丽等人[10]通过芽孢杆菌在豆粕中发酵获得蛋白酶，并根据发酵条件进行优化，获得蛋白酶产量达到约520 U/g。红曲霉是人类传统使用的有益菌，不仅可以产天然色素，还具备较强的产酶能力，但研究多为糖化酶[11-13]和酯化酶[14-16]，对其产蛋白酶方面的研究甚少。实验室从商品红曲米中分离出高糖化酶活力的紫色红曲霉MD10，为了挖掘其应用潜力，对其产蛋白酶的发酵条件进行优化，并探究其部分酶学性质。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种紫色红曲霉MD10，实验室菌保藏。

1.1.2 原料

麸皮，购于当地农产品市场。

1.1.3 试剂与仪器

试剂：乳酸、乳酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硼砂、氢氧化钠、三氯乙酸、碳酸钠、酪氨酸、酪蛋白、氯化钠、氯化钾、六水合硫酸亚铁铵、六水合氯化铁、无水硫酸镁、无水硫酸铜、一水合硫酸锰、七水合硫酸锌，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供。

仪器：UV2550型紫外分光光度计，上海旦鼎国贸有限公司产品；GHP-9160型隔水式恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；KG-SX-500型高压蒸汽灭菌器，KAGOSHIMA SEISAKUSYO（Japan）公司产品；HHS-8S型电子恒温不锈钢水浴锅，上海康路仪器设备有限公司产品；SPH-2102型立式大容量恒温培养摇床，上海世平实验设备有限公司产品。

1.2 培养基

（1）平板培养基。改良的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），取46 g于1 000 mL蒸馏水溶解混匀，加入乳酸1 mL。

（2）种子液培养基。葡萄糖60 g/L，蛋白胨30 g/L，硫酸镁1.5 g/L，硝酸钠2 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，pH值自然。

（3）初始固态发酵培养基。麸皮30 g，水30 mL，乳酸0.06 mL，置于500 mL锥形瓶中混合均匀。

以上培养基于121℃下灭菌30 min。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株活化与培养

（1）种子液培养。刮取试管斜面中的红曲霉菌株MD10于已灭菌的种子液中，置于摇床中，30℃下，以转速150 r/min培养2 d至菌丝干重7 g/L。

（2）固态发酵基培养。以麸皮固态培养基质量为基准，吸取一定量的种子液于麸皮固态培养基上，30℃下培养5 d。

1.3.2 蛋白酶活力的测定

参考QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》中的蛋白酶活力的测定方法[17]。

蛋白酶活力：以1.0 g固体干曲在40℃和pH值3.0条件下，1 min内将酪蛋白水解产生1μg氨基酸为1个酶活单位，以U/g表示。

1.3.3 固态发酵参数条件的优化

选择发酵温度、乳酸添加量和接种量进行三因素三水平的正交试验，培养5 d后检测样品的蛋白酶活力，确定该菌株产蛋白酶的最佳参数。

固态发酵参数优化的正交设计见表1。

表1 固态发酵参数优化的正交设计

1.3.4 部分酶学性质的探究

（1）粗酶液制备。称取10 g干曲，加入pH值3.0的乳酸-乳酸钠缓冲液200 mL，于4℃下搅拌浸提30 min，过滤后即为粗酶液。

（2）最适温度。取1 mL酶液（pH值3.0）分别置于25，35，45，55，65，75，85℃条件下与1 mL质量浓度为10 g/L的酪蛋白反应30 min，酶活最高值对应的温度为最适温度，以其为100%计，计算其他各温度下的相对酶活。

（3）热稳定性。分别将酶液置于35~75℃的不同温度下保温，分别在保温的不同时间（30，60，90，120 min）取出酶液，冰浴冷却，测定其蛋白酶活力，以4℃下放置的同批粗酶液的酶活为对照，计算不同温度和时间下的相对酶活。

（4）最适pH值。用乳酸-乳酸钠配制pH值为2.5，3.5，4.5，5.5的缓冲液；磷酸二氢钠-磷酸氢二钠配制pH值为6.5，7.5，8.5缓冲液；硼砂-氢氧化钠配制pH值为9.5，10.5，11.5的缓冲液，分别用不同pH值缓冲液配制质量浓度为10 g/L的酪蛋白溶液。取1 mL粗酶液与1 mL不同pH值配制的底物反应，测定其蛋白酶活力，以最高值对应的pH值为最适pH值，以最高酶活为100%，计算其他各pH值下酶液的相对酶活。

（5）pH值稳定性。用不同pH值（3.5~7.5）的缓冲液稀释等量酶液为不同pH值的酶液，置于55℃下保温，分别在保温30，60，90，120 min的时间取出酶液，冰浴冷却，测定蛋白酶活力，于4℃下放置的同批酶的活性为100%，计算不同时间保温后的酶的相对活性，用相对酶活评价pH值对酶稳定性的影响。

（6）金属离子对酶活的影响。在测定蛋白酶活力的体系中，分别加入终浓度为3 mmol/L的金属离子（Na+，K+，Fe2+，Fe3+，Mg2+，Cu2+，Mn2+，Zn2+）的盐溶液，以没有加金属离子的酶活为100%计，计算各金属离子存在时酶的相对活性[18]。

2 结果与分析

2.1 固态发酵条件的优化

L9（34）正交试验结果见表2。

由表2可知，极差RA>RC>RB，说明发酵温度（A）对紫色红曲霉MD10产蛋白酶的影响最大，其次是接种量（C）和乳酸添加量（B）。

表2 L9（34）正交试验结果

29℃的发酵物状态见图1，32℃的发酵物状态见图2，35℃的发酵物状态见图3。

图1 29℃的发酵物状态

图2 32℃的发酵物状态

图3 35℃的发酵物状态

2.2 酶学性质的分析

2.2.1 最适温度温度对MD10蛋白酶活性的影响见图4。

图4 温度对MD10蛋白酶活性的影响

由图4可见，该蛋白酶的最适反应温度为55℃。在25~55℃内酶活力随着温度的升高而逐渐升高，由50%上升到100%；当温度从65℃上升至75℃时，相对酶活从81%快速降低为22%，说明温度对该酶的影响较大，85℃时，仅为5%，基本失活。

2.2.2 热稳定性

MD10蛋白酶的热稳定性见图5。

图5 MD10蛋白酶的热稳定性

由图5可见，在分别保温了30，60，90，120 min后，各个温度的酶活均有下降。当温度在35，45℃时，该蛋白酶稳定性较好，保温120 min后，酶活分别为80%，70%以上；55~75℃下该蛋白酶不稳定，伴随时间的增加，酶活持续降低；75℃保温120 min后酶活约为7.1%，表明该蛋白酶不适合高温条件的应用场合。

2.2.3 最适pH值

pH值对MD10蛋白酶活性的影响见图6。

pH值对微生物的生长影响显著，不同的红曲霉所产生的蛋白酶的特性均有所差异。由图6可知，MD10蛋白酶的最适pH值为4.5。在pH值3.5~6.5内，酶活保持在80%以上；当pH值低于3.5后，酶活急速下降；pH值大于7.5后，酶活下降加快，在pH值9.5~11.5内，保持10%左右的活性。结果可推测，MD10蛋白酶主要是酸性蛋白酶。Masaaki Y等人[20]进行了红曲霉3403菌株酸性蛋白酶的纯化并对其性质做了探究，其蛋白酶的最适pH值为3.0。

图6 p H值对MD10蛋白酶活性的影响

2.2.4 pH值稳定性

MD10蛋白酶的pH值稳定性见图7。

图7 MD10蛋白酶的p H值稳定性

由图7可知，在保温30，60，90，120 min后，pH值3.5、pH值4.5 2个条件下，酶活较稳定，保温120 min后能保持70%左右的活性；pH值5.5时，酶活稳定性减弱，保温120 min后，酶活为51%；当pH值6.5、pH值7.5时，随保温时间的延长，酶活持续降低，保温120 min后，相对酶活分别为32%和11%。

2.2.5 金属离子对酶活的影响

金属离子对酶活的影响见图8。

图8 金属离子对酶活的影响

由图8可看出，Na+，K+，Fe2+，Fe3+，Mg2+及Zn2+对该蛋白酶酶活有一定的抑制作用，其中Zn2+，Mg2+抑制作用最强；Cu2+，Mn2+对其有促进作用，且Mn2+比Cu2+的促进效果明显。

3 结论

对紫色红曲霉MD10产蛋白酶的发酵条件进行了优化，并且对其部分酶学性质进行了测定，得到最佳发酵条件为温度32℃，乳酸添加量1‰，种子液接种量9%，在此条件下，其蛋白酶产量达到338.15 U/g，是优化前的2.3倍。其酶学测定结果表明，最适温度为55℃，最适pH值为4.5，酶在35~45℃保持较好的稳定性；pH值3.5~5.5内保温120 min后，酶活能保持在68%以上；Na+，K+，Fe2+，Fe3+，Mg2+及Zn2+对酶活有一定的抑制作用，其中Zn2+，Mg2+抑制作用最强；Cu2+，Mn2+对其有促进作用。该研究结果为紫色红曲霉MD10在酿酒行业及酶制剂行业的应用提供一定的科学数据。