冠突散囊菌固体发酵铁观音茶的主要活性成分及其抗氧化性分析

邹金美，宋宗仁，蔡咚玲，蔡滨雅，张敬虎，张国广,

（1.闽南师范大学生物科学与技术学院，福建漳州 363000；2.闽台特色园林植物福建省高校重点实验室，福建漳州 363000）

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）又名金花菌，是茯砖茶制作过程中，在特殊的温度、湿度等环境调节下，通过“发花”过程而生长起来的自然的有益的一种真菌[1]。茯砖茶制作完成后由冠突散囊菌产生的黄色闭囊壳，均匀地附着在茶叶中，俗称“金花”[2]。毒理学研究结果表明，金花菌属于无毒微生物[3-4]，可以在绿茶、白茶、乌龙茶、黑茶等多种茶叶中生长[5-11]，也能在其它植物材料中生长[12-13]。茶叶经过冠突散囊菌发酵后，化学成分发生了较大的变化，发酵产物具有很好的抗氧化、抑菌、调节肠道菌群平衡、提高免疫力、降血脂、抗肿瘤等活性[5-10]，因此冠突散囊菌在发酵食品领域具有很大的应用前景[12-13]。

铁观音（Camellia sinensiscv.Tieguanyin）是福建的名茶之一，属于半发酵乌龙茶[14]。铁观音一年可采春、夏、暑、秋四期茶，一般认为中秋节后的秋季是产最好品质铁观音茶的季节，夏暑时节生产的铁观音茶品质一般[14]。近几年国内种植结构调整，茶园面积快速增加，茶叶总产量也快速增加，国内局部地区茶叶出现了供大于求的现象[15]，尤其人们对高品质茶叶的需求较大，导致低端茶叶销售困难。如何改进提高夏暑铁观音茶品质，是茶产业发展中值得研究的课题。基于冠突散囊菌固体发酵能有效转化茶叶中有效成分的特点，本研究拟比较冠突散囊菌发酵铁观音茶后对其主要活性成分、营养成分及其抗氧化能力的影响，为夏暑季铁观音茶青的高值化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

暑季铁观音 2019购买自漳州茶叶市场，产地为福建省安溪县；冠突散囊菌（Eurotium cristatum）菌种（CICC2650） 学院微生物实验室保存；芦丁、齐墩果酸 均为HPLC级标准品，中国食品药品检定研究院；没食子酸 化学纯，Sigma公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、2,4,6-三（2-吡啶基）-1,3,5-三嗪（TPTZ）、3-（2-吡啶基）-5,6-双（4-磺苯基）-1,2,4-三嗪二钠盐（Ferrozine） 梯希爱上海化成公司；麸皮 市售；果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、谷氨酸、无水乙醇等试剂 分析纯，国药集团。

Waters 2487高效液相色谱仪、Acquityuplc Hclass超高效液相色谱仪 沃特世科技（上海）有限公司；Multiskan Go全波长酶标仪 Thermo Scientific公司；UV-1100分光光度计 上海美谱达公司；TGL-20M冷冻离心机 长沙湘仪公司。

1.2 实验方法

1.2.1 冠突散囊菌菌种活化 制作马铃薯琼脂斜面试管，超净工作台内从冠突散囊菌保存母种中用接种环挑取菌种后，在斜面试管中划线，28 ℃培养箱内培养一周后使用。

1.2.2 冠突散囊菌固体菌种制备 将麦子麸皮加入适量水后拌匀（使含水量约60%），分装入三角瓶中，放置于高压灭菌器中128 ℃，灭菌2 h。超净台上冷却至室温后，用接种锄挖取1.2.1活化的冠突散囊菌菌种接种于麸皮培养基中，放入培养箱中28 ℃培养约2周，中间适时抖动三角瓶使冠突散囊菌在麸皮培养基中均匀生长。

1.2.3 冠突散囊菌固体发酵茶叶 称取干燥的铁观音茶叶50 g装入17 mm×170 mm大小的聚丙烯塑料袋中，加入蒸馏水80 mL，使茶叶含水量约为60%，在袋口裹入棉花，用棉绳系紧，抖动塑料袋，让茶叶充分接触蒸馏水。放入高压灭菌器中于128 ℃条件下灭菌2 h，结束灭菌后取出置于超净工作台中冷却至室温。

将冠突散囊菌麸皮菌种在超净工作台中转接入灭完菌的铁观音茶叶中，每包接种约2 g的麸皮菌种，设置不接菌的对照组。将接完种的茶叶菌包放入28 ℃的生化培养箱中培养30 d左右，待观察到冠突散囊菌分布到整个菌包，发酵结束。同时将对照组也放置在同一个培养箱中放置同样的时间。取出发酵好的茶叶和对照组均于60 ℃的干燥箱中烘至恒重。

1.2.4 可溶性总糖、单糖和二糖含量的测定 分别称取2种茶叶投入到蒸馏水中，料液比为1:10，加热至沸腾并保持30 min，过滤取滤液；滤渣中再次加入等量的蒸馏水，再次煮沸并保持30 min，过滤取滤液，合并两次滤液并用蒸馏水定容，即得到测总糖的提取物。采用苯酚-硫酸法测定提取物中可溶性总糖含量[16]，以葡萄糖为标准品，测得的标准线性回归方程为y=8.2x+0.0327，R2=0.9721，x单位为g/L。参考文献[17]，采用超纯水配制可溶性糖标准品和5种浓度的混合标准工作液，采用高效液相色谱法测定可溶性果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的含量。记录出峰时间和峰面积进行定性和定量分析，以e为底对标准液的浓度求导所得值为横坐标，以e为底对相应的峰面积求导所得值为纵坐标。

1.2.5 游离氨基酸含量的测定 按照GB/T 8314-2013《茶 游离氨基酸总量的测定》进行测定。谷氨酸作为标准品，测得的标准线性方程为y=2.7643x-0.0176，R2=0.9992，x单位为g/L。用蒸馏水提取氨基酸，料液比为1:10，70 ℃下震荡提取30 min，提取结束后10000 r/min离心5 min，吸取上清液于容量瓶中。剩余的残渣重复用蒸馏水浸提一次，合并上清液，用蒸馏水定容即为样品测试母液。

1.2.6 黄酮类和总三萜含量的测定 采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定提取物中黄酮类含量[16]，以无水乙醇配制的芦丁为标准品，测得的标准曲线回归方程为y=0.3723x+0.0074，R2=0.9953，x单位为g/L，用水为溶剂提取黄酮类物质，提取方法参照1.2.5。

采用香草醛-高氯酸显色法测定提取物中总三萜物质含量[18]，以无水乙醇配制的齐墩果酸为标准品，测得的标准线性方程为y=8.4911x-0.0112，R2=0.9915，x单位为g/L。总三萜类物质提取溶剂为无水乙醇，提取方法和参数参照1.2.5。

1.2.7 茶多酚含量的测定 采用福林酚法测定发酵组和对照组中的多酚类物质含量[19]，首先用蒸馏水提取样品有效成份，提取温度100 ℃，其他参数参照1.2.5，以无水乙醇配制的没食子酸为标准品测得的标准曲线回归方程为y=16.814x+0.0305，R2=0.9879，x单位为g/L。

1.2.8 咖啡因含量的测定 根据GB 5009.139-2014《食品安全国家标准 饮料中咖啡因的测定》进行测定，咖啡因提取参照1.2.5方法。准确吸取10 μL浓度分别为5、10、20、50、100 μg/mL的咖啡因标准液，加样到Acquityuplc H-class超高效液相色谱仪中，测定标准液的峰面积。以不同浓度的标准液（单位为μg/mL）为横坐标，纵坐标为与之对应的峰面积。

1.2.9 儿茶素含量的测定 根据GB/T 8313-2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》进行，Waters 2487高效液相色谱仪中进行测定。样品有效成分的浸提采用甲醇为溶剂，提取方法参照1.2.5，10 μL儿茶素标准溶液（5 μg/mL）上样液相色谱仪中，相同操作和色谱条件下，进行冠突散囊菌固体发酵组和对照组提取液测试，根据峰面积大小和出峰时间分析各成分的含量。

将测得的样品的峰面积代入下式，得出发酵组和对照组儿茶素的含量。

式中：X—儿茶素含量，%；A—所测样品中被测成分峰面积；As—标准工作液的峰面积；c—标准工作液的浓度，μg/mL；V—样品提取液的体积，mL；F—提取液的稀释倍数；m—样品称取量，g。

1.2.10 茶黄素（TF）、茶红素（TR）、茶褐素（TB）和茶汤光谱的测定 茶色素按照比色系统分析法测定[20]，茶色素提取采用热水浸提法，方法参照1.2.4。分别称取两种茶叶各2 g，加入100 mL沸水浸泡30 min后离心取上清液即茶汤，在300～800 nm范围进行茶汤光谱扫描。

1.2.11 抗氧化能力的测定 用蒸馏水沸水浸提法提取，分别将对照组和冠突散囊菌发酵组2种提取物，配成浓度以样品干物质量计的不同浓度的测试液。总还原力测定、Fe3+还原抗氧化能力的测定、DPPH自由基、ABTS+自由基和羟自由基清除能力的测试方法参考文献[16]进行。

1.3 数据处理

样品测定采用3次重复。实验结果用SPSS17.0软件进行统计分析，运用Origin6.1软件作图。

2 结果与分析

2.1 糖类和游离氨基酸测定结果

果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的标准液相色谱如图1所示。由图1可知，果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖保留时间分别为5.589、6.567、8.742、9.735 min。所得果糖标准回归方程为：y=1.69x+5.73，R2=1；葡萄糖标准回归方程为：y=1.61x+6.23，R2=1；蔗糖标准回归方程为：y=1.61x+6.40，R2=1；麦芽糖标准回归方程为：y=1.61x+6.40，R2=1。

图1 可溶性单糖和二糖标准液相色谱图Fig.1 Standard liquid chromatogram of soluble sugar

由表1可知，冠突散囊菌发酵的铁观音茶叶中水溶性总糖显著（P＜0.05）高于对照组，果糖、蔗糖和麦芽糖均未检出，葡萄糖含量显著增加（P＜0.05），推测冠突散囊菌生长过程中分泌的酶可以分解利用铁观音茶叶中的物质，尤其是糖类，然后在菌体构建过程中重新产生可溶解于水的糖类物质[9]。发酵茶溶解于水的游离氨基酸的含量显著（P＜0.05）降低，推测冠突散囊菌菌丝生长利用了茶叶中的氨基酸用于自身菌体蛋白的合成。冠突散囊菌发酵绿茶[9]中也发现发酵后游离的氨基酸含量显著性降低。

表1 两种茶中的营养物质测定结果（%）Table 1 Determination results of several nutritional ingredients in 2 kinds of tea (%)

2.2 四种活性物质测定结果

图2 为咖啡因标准液色谱图。如图2可知，咖啡因保留时间为3.824 min。所得咖啡因标准回归方程为：y=27062x-370.62，R2=0.9999。

图2 咖啡因STD 10标准液相色谱图Fig.2 Caffeine STD 10 standard liquid chromatogram

由表2可知，发酵茶中总黄酮和三萜类物质含量有显著性增加（P＜0.05），推测在冠突散囊菌菌丝的生长过程中，能分解利用铁观音茶叶中的物质生成黄酮类物质和三萜类物质，刘菲等[21]用冠突散囊菌发酵白茶中也发现白茶发酵组的总黄酮含量显著性增加。发酵铁观音茶的茶多酚含量有显著性下降，冠突散囊菌有分解和利用茶多酚的能力，茶多酚通常也是茶叶苦涩味来源的主要物质，茶多酚含量的下降表明发酵茶苦涩味会下降。冠突散囊菌发酵多种茶的研究都表明，茶叶经过冠突散囊菌发酵后茶多酚的含量显著性下降[9,21-24]。发酵组铁观音茶的咖啡因与对照组比没有显著性变化，可能因为咖啡因是含有多个氮原子的杂环类化合物，性质比较稳定，不易被冠突散囊菌分解利用[24]，陈琳琳等[25]研究结果也表明冠突散囊菌发酵能使茶叶的咖啡因含量上升5.53%。

表2 两种茶中的活性物质测定结果（%）Table 2 Determination results of several active components in 2 kinds of tea (%)

2.3 儿茶素类物质含量测定结果

儿茶素是茶叶中的茶多酚类物质的重要组分，其标准液相色谱图见图3。由图3可知EGC、+C、EC、EGCG、ECG保留时间分别为9.701、13.026、20.171、21.545、26.224 min。

图3 儿茶素标准液相色谱图Fig.3 Standard liquid chromatogram of catechin

由表3可知，发酵后总儿茶素含量显著（P＜0.05）下降；发酵后简单型儿茶素如表没食子儿茶素（EGC）、儿茶素（+C）和表儿茶素（EC）三种含量显著性增加（P＜0.05），酯型儿茶素如表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和表儿茶素没食子酸酯（ECG）含量显著性下降（P＜0.05），其中EGCG下降了92.2%（表3）。可能是因为冠突散囊菌在其菌丝生长中能分泌相应的酶分解茶叶中的酯型儿茶素生成了部分简单儿茶素类分子，使三种简单型儿茶素浓度升高；其中对照组含量最高的EGCG分解率达到了92.2%，也是导致发酵后总儿茶素降低的主要原因。陈琳琳等[25]研究也发现冠突散囊菌发酵使EC含量上升42.02%，EGC上升4.12%。

表3 两种茶中的儿茶素测定结果（%）Table 3 Determination results of catechins in two kinds of tea (%)

2.4 茶色素和茶汤光谱测定结果

铁观音被冠突散囊菌发酵后茶色素发生较大变化，与对照组相比发酵组茶褐素（TB）和茶红素（TR）含量显著性（P＜0.05）增加，茶黄素（TF）显著性（P＜0.05）减少（表4）。一般认为茶色素是茶多酚中儿茶素经氧化聚合生成的聚合物，也被称为儿茶素氧化聚合物，经过冠突散囊菌发酵后减少的儿茶素可能一部分在真菌酶促作用下聚合形成了茶褐素和茶红素。冠突散囊菌在发酵黑茶汤中也发现初期儿茶素被酶氧化为茶黄素，茶黄素继续氧化聚合成茶红素和茶褐素[11]，在其它真菌发酵茶叶中也有发现随着真菌的发酵，茶多酚含量急剧减少，茶色素含量增加的现象[24]。如图4所示，从茶汤光谱可以看出等量的干茶样水浸出物相比，发酵后400～600 nm范围内的吸光值明显增加，其它波长范围内基本保持一致。茶褐素在可见光范围内波长越短吸光值越大[26]，黄色溶液的最大吸收波长约在450～480 nm，红紫色溶液的最大吸收波长在490～560 nm左右[27]，茶红素和茶褐素的增加会导致400～600 nm的吸光值增加，光谱扫描结果进一步证实了这一结果。

表4 两种茶中的茶色素测定结果Table 4 Determination results of tea pigment in two kinds of tea

图4 两种茶汤的光谱图Fig.4 Spectrogram of two kinds of tea soup

2.5 总还原力

还原力测定结果表明对照组和发酵组都具有较好的总还原能力（图5），且在试验设定的浓度范围内随着浓度的升高，总还原力呈上升趋势。茶叶经过发酵后的提取物总还原能力并没有明显的下降，可能是因为茶叶发酵后尽管茶多酚含量降低，但黄酮类物质含量增加，二者中都有一些分子具有较好的还原能力[19,28]。

图5 两种茶的总还原力测定结果Fig.5 Determination results of total reducing capacity of two kinds of tea

2.6 清除DPPH自由基能力比较

发酵组和对照组在所设定的6.25～50 mg/L浓度范围内随着浓度的升高（图6），DPPH自由基的清除能力呈上升的趋势。发酵组与对照组等浓度比较DPPH自由基清除能力略有增强，最低浓度下对照组清除率为40.77%，发酵组为40.86%，最高浓度发酵组为91.7%，对照组清除率为90.04%。欧阳梅等[5]也发现冠突散囊菌发酵的绿茶仍具有较强的DPPH清除能力，本研究中发酵组DPPH自由基清除率较强的原因可能是发酵组黄酮含量比对照组高，黄酮类物质一般均具有很好的DPPH自由基清除能力[28-29]。

图6 两种茶DPPH自由基清除能力结果Fig.6 Determination results of scavenging DPPH ability of two kinds of tea

2.7 ABTS+自由基清除能力的测定

铁观音茶叶的冠突散囊菌发酵组和对照组的提取物在所设定的浓度范围内随着浓度的提高对ABTS+自由基的清除率呈现上升的趋势（图7）。相同浓度下发酵组清除ABTS+自由基的能力更强，对ABTS+自由基清除能力的变化可能与发酵后铁观音黄酮类物质含量的增加有关。文治瑞等[29]的研究也表明金花茶中的黄酮类物质具有很好的清除ABTS+自由基的能力。

图7 两种茶ABTS+自由基清除能力结果Fig.7 Determination results of scavenging ABTS+ability of two kinds of tea

2.8 清除羟基自由基能力比较

清除羟基自由基能力比较结果（图8）表明，发酵组和对照组均具有较高的羟自由基清除能力，且在所设定的浓度范围内随着浓度的增加羟基自由基清除率随之增强，同样浓度下发酵组清除羟自由基能力更强，可能与发酵后铁观音的茶黄酮和茶色素，尤其茶褐素含量的增加有关，吕娜等[30]研究发现茶黄酮具有很好的清除羟基自由基的能力。

图8 两种茶羟基自由基清除能力结果Fig.8 Determination results of scavenging hydroxyl radicals ability of two kinds of tea

2.9 Fe3+还原能力的测定

发酵组和对照组2种水提物在系列浓度0.04～0.2 g/L的范围内，随着浓度的升高，Fe3+还原力呈上升趋势，与对照组相比发酵后的铁观音组Fe3+还原力增强（图9），可能是因为冠突散囊菌发酵后茶叶中黄酮类物质和茶褐素含量增加所致。

图9 两种茶Fe3+还原能力结果Fig.9 Determination results of Fe3+ reduction ability of two kinds of tea

3 结论与讨论

冠突散囊菌是从茯砖茶中分离到的一种天然的真菌，能耐受茶叶中的酚类物质，且能够分解利用转化茶叶中酚类物质[9-11]，本研究中铁观音茶发酵后多酚含量也显著性（P＜0.05）下降，儿茶素是茶多酚的主要组成成分，总儿茶素含量下降，但儿茶素中的简单型儿茶素（EGC、+C和EC）含量显著性（P＜0.05）增加，酯型儿茶素含量（EGCG和ECG）显著性（P＜0.05）下降，推测可能部分酯型儿茶素被酶降解后生成简单型儿茶素和没食子酸。黄浩[24]发酵实验中也发现酯型儿茶素下降明显，简单型儿茶素在发酵过程中呈现先上升再下降的趋势，本研究的简单型儿茶素含量增加也可能是发酵取样时间有关。茶叶发酵后咖啡因含量没有明显变化，可能是冠突散囊菌不能分解利用咖啡因分子[24]。冠突散囊菌发酵后茶红素和茶褐素的含量显著性增加，茶汤颜色呈现红褐色，可能是菌类生长中分泌的酶催化了酚类物质或茶黄素氧化形成茶褐素和茶红素[5,10]；发酵后总糖含量增加，单糖中葡萄糖含量显著性增加，但果糖、蔗糖和麦芽糖检测不出，可能是冠突散囊菌生长中优先利用这些糖类物质生成了葡萄糖和其它水溶性糖类[9]。

抗氧化实验结果表明铁观音有较强的抗氧化活性，经过冠突散囊菌发酵后仍然具有很好的抗氧化活性，一般认为茶多酚、黄酮类物质、真菌多糖、茶色素和三萜类物质均具有很好的抗氧化活性[28-31]，冠突散囊菌发酵后茶多酚含量显著性（P＜0.05）下降，但黄酮类物质、茶色素和三萜类物质仍然赋予发酵的铁观音茶较好的抗氧化活性。茶汤的滋味是由具有涩、苦、鲜、酸、咸六大类的呈味物质协调所组成的，茶叶中苦涩味一般是茶多酚和儿茶素类物质带来的，氨基酸和茶色素会呈现鲜味和刺激爽口味[32]，冠突散囊菌发酵降低了茶叶中苦涩的呈味物质，增加了鲜味和甜味的呈味物质茶色素和总糖，一定程度上能改善夏暑季铁观音的营养和饮用风味。