鼠伤寒沙门氏菌生物被膜的清除效果研究

郑丽平，陆兆新，孔梁宇，胡安妥，孟凡强，别小妹

（南京农业大学食品科技学院，江苏南京 210095）

鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）是引起急性胃肠炎的主要病原菌之一，是目前世界各国分离率最高的菌型之一[1]。它能引起各种家禽和哺乳动物的传染病，也可造成人类感染，对食品安全和公共卫生具有重要的影响[2-3]。

在食品工业中，S. typhimurium常以生物被膜的形态存在于加工器械表面。生物被膜（biofilm）是一种复杂的多糖蛋白复合物，它由附着在接触面的细菌以及细菌分泌的胞外聚合物（EPS）组成。一旦生物被膜形成之后，菌体对宿主免疫系统的抵御能力增强，对常用的消毒剂、抗生素等也表现出更强的耐受性[4-6]。与浮游细菌相比，生物被膜菌对各种杀菌剂和环境变化的敏感性大大降低，对抑菌成分的耐受性也更强，这使清除食品加工设施上的生物被膜成为一个巨大的挑战[7-8]。

S. typhimurium生物被膜的形成往往在固液相交界处，是一个动态的过程。生物被膜形成初始时，菌体在固体接触面附着，随着细菌生长繁殖，菌体数量逐步增大。当菌体达到一定浓度时，细菌感应到浓度信号，生长状态开始变化，多糖、胞外蛋白等开始合成，逐渐形成成熟的生物被膜[9-10]。当菌体感应到外界环境适应时，生物被膜脱落使菌体暴露而重新游离，直至遇到新的条件而再次形成生物被膜，如此往复，对食品工业造成较大困扰[11-12]。

目前对于生物被膜的控制方法主要包括以下几种：物理法、化学法和生物法。物理法有超声波法、电击法、紫外照射等；化学方法主要是指一些化学消毒剂、表面活性剂、金属螯合物等；生物法目前研究主要集中于抗生物及其衍生物、抗菌药物联合使用、天然产物等[13-14]。其中物理法中研究较多的是超声波处理和紫外照射，李燕杰等[15]用超声波对单核增生李斯特菌生物被膜进行处理，得出当超声功率为250 W、温度35 ℃和时间7 min时，被膜清除率可达到96.34%的结论；翟立公等[16]的研究发现：“84”消毒液、过氧化氢、“果蔬净”对生物被膜都有清除作用，可以使部分生物被膜脱落。“84”消毒液对生物被膜中菌体的杀菌效果最好；过氧化氢只有高浓度时可以杀灭生物被膜中的菌；“果蔬净”几乎没有杀菌作用。常冰雪[17]用乙醇、洗洁精和过氧化氢对铜绿假单胞菌生物被膜进行处理发现，过氧化氢具有很好的清除效果，在实验设置最高浓度（6%）下能清除超过50%的生物被膜。“84”消毒液在有效氯含量在256 μg/mL时仅能清除20%左右的生物被膜。这说明不同种属的菌株可能对消毒剂或是抑菌物质的耐受性是不同的。近几年对生物被膜的控制研究多集中于天然植物提取物或是生物制剂方面。如戴雨芸等[18]发现香芹酚对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制和生物被膜的清除均有较强作用效果。朱军莉等[19]的实验结果表明，随着茶多酚和葡萄籽提取物作用质量浓度增加对假单胞菌生长和生物被膜的抑制作用增强，但在清除成熟生物被膜方面没有较好的作用。王琳等[20]的研究结果显示金银花提取物和蒲公英提取物可以破坏假单胞菌生物被膜结构，从而清除生物被膜，并且清除效果随质量浓度的增加而逐渐增强。

本研究分别选取了食品工业常用的几种消毒剂、食品工业常用的食品防腐剂以及几种天然成分。从对S. typhimurium生物被膜的形成过程及清除效果着手，评估各类清除剂在控制S. typhimurium生物被膜方面的优劣势，可以为食品工业中该类菌株生物被膜的控制提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鼠伤寒沙门氏菌S. typhimuriumCDC3 由南京疾病预防与控制中心赠与；鼠伤寒沙门氏菌S.typhimuriumST34 南京农业大学食品科技学院酶工程实验室保存菌株，菌株在含有25%甘油的冻存管中于-80 ℃冰箱中冷冻保存；MTT（噻唑蓝）、苯扎氯铵、苯扎溴铵、香芹酚、肉桂醛、双乙酸钠、乳酸钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、乳酸链球菌素 上海麦克林试剂公司；茶多酚、百里香精油 上海源叶生物科技公司；结晶紫粉末、无水乙醇、乙二胺四乙酸（EDTA） 国药集团；十二烷基磺酸钠（SDS） 北京索莱宝科技有限公司；Tryptone Soy Broth（TSB）培养基：胰蛋白胨17 g，大豆蛋白胨3 g，氯化钠5 g，葡萄糖2.5 g，磷酸氢二钾2.5 g，去离子水1000 mL，pH7.0～7.5，115 ℃灭菌30 min；Luria-Bertani（LB）培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，pH7.0～7.5，121 ℃灭菌20 min；0.5%结晶紫配制方法：结晶紫2.5 g，草酸铵4 g，95%乙醇100 mL，400 mL去离子水，超声至完全溶解后备用。

MultiskanTMFC多功能酶标仪、T1300Ⅱ级生物安全柜 赛默飞世尔科技公司；SX-700高压蒸汽灭菌锅 日本Tomy公司；SB-5200DT超声波清洗仪

宁波新芝生物科技股份有限公司；AY120电子天平 日本岛津公司；TDL-80-2C低速台式离心机上海安亭科学仪器厂；DRP-9162恒温培养箱 上海森信实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株的活化与培养 取-80 ℃冻存的菌株S.typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST19接种于TSB液体培养基中37 ℃ 180 r/min条件下活化两次，然后接种于TSA平板上，挑取单菌落接种于新鲜的TSB培养基中37 ℃ 180 r/min过夜培养，备用。

1.2.2 不同清除剂浓度的确定 根据中华人民共和国国家标准GB 2760-2014中明确规定的各类食品添加剂的限量标准，以此确定各类清除剂的添加比例及浓度[21]，采用的清除剂见表1。根据各类添加剂的限量标准，配制相应的母液浓度，苯甲酸钠、山梨酸钾、SDS、EDTA、双乙酸钠、乳酸钠等121 ℃，灭菌20 min；苯扎氯铵、苯扎溴铵、百里香精油、香芹酚、肉桂醛、茶多酚、洗洁精、“84”消毒液、无水乙醇、30%过氧化氢等用0.22 μm滤膜过滤除菌后备用。

表1 实验中所使用的清除剂及添加量Table 1 Type and amount of scavenger used in the research

1.2.3 不同清除剂对S. typhimurium生长及生物被膜形成的影响 将已进行无菌处理的清除剂（消毒剂：洗洁精、H2O2、无水乙醇、苯扎氯铵、苯扎溴铵、EDTA和SDS；食品防腐剂：苯甲酸钠、山梨酸钾、乳酸钠和双乙酸钠；天然成分物质：香芹酚、肉桂醛、百里香精油、茶多酚和乳酸链球菌素）在原浓度的基础上进行梯度稀释，以SDS为例：SDS原浓度为1%，用TSB液体培养基将其依次稀释至0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%。将两株S. typhimurium以1%的接种量分别接种于上述稀释好的溶液中，然后吸取200 μL液体接种于96孔聚乙烯板中。每个处理设置三个平行，并设置阴性对照（只添加TSB液体培养基）和阳性对照（添加TSB液体培养基并接种1%的S. typhimurium）。于37 ℃恒温培养箱中静置培养48 h后，观察不同浓度的添加剂处理后生物被膜的形成情况并测定OD600nm处的吸光度值，然后采用结晶紫染色法对生物被膜进行定量测定。结晶紫染色法的操作步骤参考Pratt[22]和杨维青等[23]的方法，具体如下：弃去96孔板中多余培养基，用无菌水漂洗3～4次后晾干，待完全干燥后向孔中加入200 μL 0.5%的结晶紫染色液；于室温下染色30 min，染色完毕后弃去全部染色液，用无菌水漂洗3～4次洗去浮色；待完全晾干后向每孔加入200 μL 95%的乙醇，室温下放置15 min；用多功能酶标仪测定每孔在OD595nm处的吸光值，即为孔内生物被膜的生成量。同时每个处理设置空白对照，即只含TSB液体培养基不接菌液。

1.2.4 不同清除剂对S. typhimurium生物被膜的清除效果评估 将两株S. typhimurium以1%的接种量接种于TSB液体培养基中，然后吸取200 μL液体接种至96孔聚乙烯板中。每个处理设置三个平行，并设置阴性对照（只添加TSB液体培养基）和阳性对照（添加TSB液体培养基并接种1%的S. typhimurium），于37 ℃恒温培养箱中静置培养48 h。采用1.2.3中所述的结晶紫染色法测定每孔OD595nm处吸光值，即为孔内生物被膜的生成量，通过以下公式计算可得每种清除剂对生物被膜的清除率。

式中：X1为阳性对照，即不经处理时鼠伤寒沙门氏菌生物被膜的形成量；X为经过处理后S.typhimurium生物被膜的形成量。

1.2.5 MTT法测定不同清除剂处理后S. typhimurium生物被膜态细胞的代谢活性 采用MTT法对不同清除剂处理后生物被膜内细菌的相对代谢活性进行测定，具体操作步骤参考Gerlier等[24]和杨翠云等[25]的方法并稍作改动。采用1.2.4中所述的方法培养并处理生物被膜，经不同清除剂处理完毕后，无菌水清洗晾干。然后向每个孔内分别添加100 μL的TSB液体培养基和100 μL的MTT溶液（5 mg/mL），于37 ℃恒温培养箱中避光孵育2～3 h。小心弃去孔中的MTT及培养基混合液，然后用无菌水清洗除尽孔中的残液。晾干后向每个孔内添加200 μL的DMSO（二甲基亚砜）试剂，37 ℃静置15～20 min，用酶标仪测定其在OD490nm处的吸光值，即得每个孔内细胞的相对代谢活性。

1.2.6 不同清除剂处理后S. typhimurium生物被膜菌的活菌数 菌落计数法检测生物被膜中活菌数具体方法参考梁瑞[26]所描述的方法。生物被膜的培养及处理方法1.2.4中所述，经不同清除剂处理完毕后，用无菌水洗尽残液并晾干。之后，向每个孔内添加200 μL生理盐水用细胞刮刀将粘附在底部和孔壁的生物被膜刮下并溶解在生理盐水中。最后将200 μL溶有生物被膜菌的溶液转移到1.5 mL的无菌离心管中，对其依次进行十倍梯度稀释，然后涂布于LB固体培养基中，于37 ℃恒温培养箱中倒置培养24 h后进行菌落计数，然后计算经不同清除剂的不同浓度处理后两株S. typhimurium生物被膜菌的活菌数。每组处理均设置三个平行。

1.3 数据处理

每组实验重复三次，实验数据处理用平均值±标准偏差（Means±SD）表示，利用Graphpad Prism 9.0作图软件对数据进行整理和分析。

2 结果与分析

2.1 不同清除剂对S. typhimurium生物被膜形成的影响

2.1.1 食品工业常用消毒剂对S. typhimurium生物被膜形成的影响 从食品工业用消毒剂中选取了其中8种比较常见的消毒剂及抑菌成分，根据国家食品卫生标准中推荐的每种消毒剂的使用比例及最高浓度为参考。在两株S. typhimurium培养的过程中，分别将每种消毒剂以不同浓度添加到培养基中，测定不同消毒剂对细菌生长及生物被膜形成的影响，具体结果如图1所示。

图1 食品工业常用消毒剂对2株鼠伤寒沙门氏菌生物被膜形成的影响Fig.1 Effect of commonly used disinfectants in food industry on biofilm formation of two strains of Salmonella typhimurium

每种消毒剂分别设置了6个不同的浓度梯度，由结果可以看到消毒剂乙醇和H2O2在低浓度时即已表现出对两株S. typhimurium生物被膜形成的抑制作用，甚至不产生物被膜（如图1-A1B1和图1-A4B4）。而有的消毒剂如“84”消毒液、洗洁精在高浓度下才对生物被膜的形成有一定的抑制作用，如图1-A2B2和图1-A3B3所示，当“84”消毒液的比例达到1:100，才对两株鼠伤寒沙门氏菌生物被膜的形成起到完全抑制的作用。而当洗洁精的含量达到6%时，菌体仍然可以生长并且形成生物被膜。EDTA（图1-A5B5）有一定的作用，但没有表现出较明显的优势，即使是在高浓度下也没有完全抑制生物被膜的形成，CDC3和ST34菌株随着表面活性剂SDS添加量的不断增加，菌体生长逐渐受到抑制，从而生物被膜的生成能力也在下降（图1-A6B6所示）。新型工业消毒剂苯扎氯铵和苯扎溴铵（如图1-A7B7和图1-A8B8），在低浓度下（0.01%）即可以有效抑制细菌的生长，使生物被膜的形成也受到抑制。

由以上结果可以得出：几种常用消毒剂对生物被膜形成过程的抑制作用主要是通过抑制细菌菌体生长的方式实现的。八种消毒剂对两种鼠伤寒沙门氏菌生物被膜形成的影响趋势基本是一致的，乙醇、过氧化氢、苯扎氯铵和苯扎溴铵在低浓度下即可基本抑制生物被膜的形成；“84”消毒液、SDS在较高浓度下才对两种鼠伤寒沙门氏菌生物被膜的形成产生抑制效果；而洗洁精、EDTA即使在高浓度下抑制效果也理想。

2.1.2 食品工业常用食品防腐剂对S. typhimurium生物被膜形成的影响 食品工业用化学防腐剂已被证实在一定剂量及时间内可以防止食品的腐败变质并且是安全的。本次研究选取了食品中常用的四种防腐剂苯甲酸钠、山梨酸钾、双乙酸钠和乳酸钠，根据国家食品安全标准中对食品添加剂使用剂量的规定，针对每种防腐剂设置6个不同浓度，比较四种防腐剂对S. typhimuriumCDC3和ST34生物被膜形成的影响，结果如图2所示。

如图2-A1B1中所示，当苯甲酸钠的含量达到0.4%时，对S. typhimuriumCDC3和ST34生物被膜的形成才随着浓度的升高呈逐渐下降的趋势，在设置的最高浓度1.0%时可以对两株S. typhimurium生物被膜的形成起到完全抑制的作用；随山梨酸钾浓度的升高，生物被膜的形成能力也是逐渐降低的（图2-A2B2）；图2-A3B3中所示的是双乙酸钠对两株S.typhimurium生物被膜形成的影响，从图中可以看出双乙酸钠对生物被膜的形成过程几乎没有影响，随着其浓度的增加，生物被膜形成能力变化不大；乳酸钠（图2-A4B4）在随着浓度的增加时，对S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34生物被膜形成量有减少的趋势。比较这四种食品防腐剂，苯甲酸钠、山梨酸钾、乳酸钠可以通过抑制菌体生长的方式来抑制生物被膜的形成，并且抑制作用是随浓度的增加而增大的，但在低浓度下抑制效果并不是很理想。双乙酸钠对S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34则没有抑菌作用，生物被膜的形成能力受其影响变化也不大。

图2 食品防腐剂对2株鼠伤寒沙门氏菌菌体生长及生物被膜形成的影响Fig.2 Effects of food preservatives on the growth and biofilm formation of two strains of Salmonella typhimurium

2.1.3 天然成分对S. typhimurium生物被膜形成的影响 首先，确定香芹酚、肉桂醛、百里香精油和茶多酚这几种天然成分物质的最小抑菌浓度，乳酸链球菌素根据国标中规定的使用剂量确定其添加量。在培养S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34时，分别将这几种物质以不同浓度加入培养基中，测定添加前后这两株S. typhimurium生物被膜生成量的变化。

将香芹酚、肉桂醛、百里香精油加入培养基后，在含量为1.0 μL/mL时，S. typhimuriumCDC3和S.typhimuriumST34的菌体即受到明显的抑制，用结晶紫染色法测定生物被膜的形成量也很少，如图3-A1B1、A2B2、A3B3所示；茶多酚对两株S. typhimurium生物被膜形成的影响是随浓度的升高变化的，随着茶多酚含量的提高，生物被膜生成量呈下降的趋势（图3-A4B4）；而乳酸链球菌素对于两株菌生物被膜的形成能力影响不大，即使在高浓度下（1.0 mg/mL）时也没有其它几种物质的抑制作用明显，如图3-A5B5。总的来说，在所选的三大类清除剂中，其中食品工业用消毒剂乙醇、过氧化氢、苯扎氯铵、苯扎溴铵在低浓度下即可通过抑制菌体生长而抑制生物被膜的产生；四种食品防腐剂，苯甲酸钠、山梨酸钾和乳酸钠对生物被膜形成的影响与作用浓度有很大的关系，随着浓度的升高，生物被膜的形成逐步减少，而双乙酸钠对S. typhimurium的生长几乎没有太大的抑制作用；在天然食品添加剂中，香芹酚、肉桂醛和百里香精油的效果也是比较好的，在培养基中添加量1.0 μL/mL的添加剂，即可有效抑制生物被膜的生长，当然细菌的生长也受到了极大的抑制。不同清除剂对生物被膜形成的抑制主要是通过抑制菌体的生长发挥作用的。

图3 几种天然食品添加剂对2株鼠伤寒沙门氏菌生物被膜形成的影响Fig.3 Effects of several natural food additives on biofilm formation of two strains of Salmonella typhimurium

2.2 不同清除剂对S. typhimurium生物被膜的清除效果评估

2.2.1 食品工业常用消毒剂对S. typhimurium生物被膜的清除效果 在S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34形成生物被膜后，利用上述实验中选取的八种消毒剂在不同浓度下对成熟的生物被膜进行浸泡处理，然后测定处理前后生物被膜的变化。评估这几种消毒剂对成熟生物被膜的清除效果，具体结果如图4所示。

通过结晶紫染色法测定不同消毒剂浸泡处理前后S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34生物被膜在OD595nm处吸光值的变化，以阳性对照为参考，可计算得出每种消毒剂在不同浓度下对生物被膜的清除率。图4中是这八种消毒剂对S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34生物被膜的清除效果。由图中可以看出，乙醇（图4-A1）和SDS（图4-A5）对生物被膜的清除效果最高才达20%，而且随着浓度的变化，生物被膜的减少量几乎没有太大变化。“84”消毒液在较高的比例下如1:100或1:50时，对生物被膜的清除率可以达到80%左右，但有效氯成分含量较高时会对人体具有一定的刺激性，因而不是较好的生物被膜清除剂选择（图4-A2）。洗洁精（图4-A3）随着浓度的增加，清除效果呈上升的趋势。过氧化氢在含量为1%时对S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34的清除率分别可达到50%和65%左右，当其含量达到6%时，清除率可高达90%（图4-A4）。而EDTA、苯扎氯铵、苯扎溴铵（图4-A6、A7、A8）的清除效果随着浓度的增加呈逐步上升的趋势，在高浓度下可达到60%左右。在八种消毒剂中，清除效果较好的是过氧化氢，其在低浓度下即可基本达到其它几种清除剂的效果。

图4 食品工业常用消毒剂对2株鼠伤寒沙门氏菌生物被膜的清除效果Fig.4 Removal effect of common disinfectants used in food industry on 2 strains of Salmonella typhimurium biofilm

2.2.2 食品工业常用食品防腐剂对S. typhimurium生物被膜的清除效果 苯甲酸钠和山梨酸钾是食品工业中最常用的两种食品防腐剂，而双乙酸钠和乳酸钠则经常被用于禽肉制品中，禽肉制品又是S.typhimurium主要的寄主之一。四种防腐剂根据国标规定的使用剂量，在生物被膜成熟之后对其进行浸泡处理，测定生物被膜的生成量。

经四种食品防腐剂浸泡处理后，只有乳酸钠在随着浓度的增加时，清除生物被膜的效果逐渐上升（图5-A4），而苯甲酸钠、山梨酸钾和双乙酸钠在浓度不断增加时，对两株S. typhimurium生物被膜的清除趋于平缓的增加趋势，当其达到限量的最高剂量时，清除效果也仅仅达到了20%左右，如图5中A1、A2、A3所示。由测定的结果可以看出，食品防腐剂对S. typhimurium生物被膜的清除作用是很小的。食品防腐剂在一定程度上可以抑制细菌的生长，但对已经成熟的生物被膜的清除作用是很弱的。

图5 食品防腐剂对2株鼠伤寒沙门氏菌生物被膜的清除效果Fig.5 Removal effect of food preservatives on two strains of Salmonella typhimurium biofilm

2.2.3 几种天然食品添加剂对S. typhimurium生物被膜的清除效果 香芹酚、肉桂醛、百里香精油、茶多酚是从天然植物中提取得到的物质，乳酸链球菌素是乳酸链球菌产生的一种多肽物质，也被广泛用作食品防腐剂。这些物质相比食品工业用的消毒剂和防腐剂而言具有无毒、无害、无副作用等特点。利用这几种物质对成熟的S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34的生物被膜浸泡处理，比较浸泡前后生物被膜的变化，可以评估这几种天然成分对生物被膜的清除效果。

经几种天然成分处理后，分别测定每孔OD595nm处的吸光值，计算得到每种物质在不同浓度下的清除率，如图6中所示。香芹酚、肉桂醛和百里香精油这三种物质随着添加量的变化，清除作用也在逐步地增大，当其添加量达到10 μL/mL时，清除率可达到70%左右（图6-A1、A2、A3）。当茶多酚的含量为0.1%时，对S. typhimuriumCDC3的清除率在40%左右，对S. typhimuriumST34的清除率达到80%左右，随着含量的增加，清除效果还有增加的趋势（图6-A4）。S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34的生物被膜经不同浓度的乳酸链球菌素处理过后，其减少量变化并不是很大（图6-A5）。相比其它几种物质来说，乳酸链球菌素在清除生物被膜的效果上并没有很大的优势。

图6 几种天然食品添加剂对2株鼠伤寒沙门氏菌生物被膜的清除效果Fig.6 Removal effect of several natural food additives on the biofilm of two strains of Salmonella typhimurium

香芹酚为单帖酚类物质，肉桂醛为醛类物质，而百里香精油中的主要成分为百里酚、沉香醇、香荆籍酚、龙脑、芫荽油醇、松油烃、丁香烃等，茶多酚是一种多酚类物质，具有较强的抗氧化性和抑菌性[18,27]。成熟生物被膜经这四种物质处理后，可观察到生物被膜开始变得松散，从孔板底部和侧壁部分脱落并且随着添加量的增加生物被膜变得愈松散，推测可能是香芹酚、肉桂醛和百里香精油破环了生物被膜致密的三维结构，才使得其易于从接触材料表面脱落[28]；乳酸链球菌素目前报道较多的是可抑制革兰氏阳性菌的活性，而对革兰氏阴性菌的抑制效果不佳，因而可能无法对成熟生物被膜产生作用[29]。综合比较这三大类物质对成熟生物被膜的清除效果，其中最为理想的是过氧化氢，在浓度为1%时，清即可清除50%～60%左右的生物被膜；其他的有洗洁精、EDTA、苯扎氯铵、苯扎溴铵随着浓度的增加对生物被膜的清除效率也是上升的，在高浓度下的效果较好；食品防腐剂对于成熟生物被膜的清除作用并不理想，除乳酸钠在最高浓度下的清除效率较高一些在60%，其他三种在设置的最大浓度下，清除率也仅有20%左右；天然食品添加剂香芹酚、肉桂醛、百里香精油对于生物被膜的清除也有一定的效果，当其添加量为10.0 μL/mL时，清除率可到70%～80%。

食品工业用消毒剂过氧化氢和“84”消毒液为强氧化剂，在加入过氧化氢后，孔内的生物被膜立即开始溶解，也即说明生物被膜中的成分与强氧化剂过氧化氢发生了反应，从而使大量的生物被膜溶解[30-31]，而“84”消毒液只有在高浓度下才有此效果；苯扎氯铵、苯扎溴铵则均为阳离子表面活性剂，可以和生物被膜中游离的部分自由基结合，从而降解部分生物被膜，洗洁精的主要成分物质也是表面活性剂，可以溶解、分散生物被膜中的部分物质，从而达到清除生物被膜的效果[32-33]。而食品防腐剂主要是通过抑制破坏或损伤微生物的细胞壁或细胞膜而抑制其生长，而成熟生物被膜具有致密的膜状结构，导致防腐剂不能发挥更好的清除作用[34-35]。而天然成分物质多是萜类、酚类及醛类物质，这些物质可以分散或是破坏成熟生物被膜的结构，从而清除部分生物被膜，具体破坏生物被膜结构的机制还需进一步的探索[27]。

2.3 不同清除剂处理后S. typhimurium生物被膜态细胞的代谢活性和活菌数

2.3.1 食品工业常用消毒剂处理后S. typhimurium生物被膜态细胞的代谢活性和活菌数 不同清除剂处理后，通过MTT法测定每个孔在OD490nm处的吸光值，并以阴性对照和阳性对照为参考，比较消毒剂浸泡后生物被膜菌的代谢活性，并通过平板稀释涂布法对处理后生物被膜中的活菌数进行定量，以此评估不同消毒剂对生物被膜内细胞的杀死效果，具体结果如图7所示。

经乙醇、过氧化氢、苯扎氯铵和苯扎溴铵四种消毒剂处理后，S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34生物被膜内细胞的代谢活性随着消毒剂浓度的增加呈降低的趋势，其内的活菌数下降了5～6个lg值（图7-A1B1、A4B4、A7B7和A8B8）。“84”消毒液在稀释比例低于1:150时，生物被膜内细胞的代谢活性才受到完全抑制，但平板涂布后发现被膜菌内仍有大量活菌存在（如图7-A2B2），这说明经高浓度的“84”消毒剂处理后，细菌可能只是暂时处于休眠状态，一旦培养条件适宜即可再次恢复活性。S.typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34生 物被膜菌内细胞代谢活性随洗洁精浓度的增加有轻微的降低，没有很明显的趋势，并且平板计数后可以看到有大量的活细胞存在，这可能是由于生物被膜致密的结构增加了菌体对洗涤剂的耐受能力；EDTA和SDS可以降低S. typhimuriumCDC3生物被膜内细胞的代谢活性，但并没有完全杀死细菌，当培养条件合适时，大量细菌恢复活力又得以继续生长，对S.typhimuriumST34来说，这两种物质对生物被膜菌代谢活性虽有影响但没有完全抑制，并且和CDC3一样，只是使生物被膜内的细菌暂时处于“亚致死”状态。

图7 消毒剂处理后2株鼠伤寒沙门氏菌生物被膜态细胞的代谢活性和活菌数Fig.7 Metabolic activity and viable bacteria count of two strains of Salmonella typhimurium biofilm cells treated with disinfectant

2.3.2 食品工业常用食品防腐剂处理后S. typhimurium生物被膜细胞的代谢活性 4种食品防腐剂处理后，S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34生物被膜菌代谢活性及活菌数的变化结果如图8所示。随着苯甲酸钠、山梨酸钾、乳酸钠浓度的增加，其生物被膜内细胞的代谢活性呈现降低的趋势，但是到达设置的最高浓度时也没有完全使生物被膜内细胞失活如图8-A1B1、A2B2、A4B4中的柱状图所示；对被膜内的活菌数和定量计算发现，随浓度的增加活菌数下降的并不是很多，苯甲酸钠和山梨酸钾作用后，只下降了1～2个lg值（图8-A1B1、A2B2中折线图），乳酸钠作用后，下降了3～4个lg值（图8-A4B4中折线图）；而双乙酸钠处理后，不管是生物被膜内的细胞的代谢活性还是活细胞数变化都不是很大（图8-A3B3），这说明双乙酸钠对鼠伤寒沙门氏菌的抑制或杀灭作用很弱。

图8 食品防腐剂处理后2株鼠伤寒沙门氏菌生物被膜细胞的代谢活性和活菌数Fig.8 Metabolism activity and viable count of the biofilm cells of two Salmonella typhimurium strains treated with food preservatives

2.3.3 几种天然食品添加剂处理后S. typhimurium生物被膜细胞的代谢活性和活菌数 菌株CDC3和ST34生物被膜细胞经香芹酚、肉桂醛、百里香精油处理后，代谢活性明显降低，并且随着添加量的增加，生物被膜细胞的代谢活性不断降低直至完全受到抑制，其内的活菌数随着添加剂浓度的升高不断降低，由起初的lg8下降到lg3左右（如图9-A1B1、A2B2、A3B3）；茶多酚对生物被膜细胞代谢活性的影响趋势和上述三种物质是一致的，但抑制效率稍弱一些，其内的活菌数有小幅度的下降（图9-A4B4）；而乳酸链球菌素对于生物被膜内细胞的代谢活性影响不是很明显，平板计数结果也显示，乳酸链球菌素处理后，生物被膜内仍然有大量活菌存在（图9-A5B5）。

图9 天然食品添加剂处理后2株鼠伤寒沙门氏菌生物被膜细胞的代谢活性和活菌数Fig.9 Metabolism activity and viable bacteria count of two strains of Salmonella typhimurium biofilm cells treated with natural food additives

在所有选择的三大类清除剂中，乙醇、过氧化氢、苯扎氯铵和苯扎溴铵这四种食品工业用消毒剂可以较好地抑制生物被膜内细胞的代谢活性，且可以大大降低被膜内的活菌数；4种食品防腐剂处理后对于生物被膜内细胞代谢活性和活菌数有一定的影响，但效果不是很明显；另外，香芹酚、肉桂醛和百里香精油在杀灭生物被膜内活细胞方面也有很好的效果，乳酸链球菌素几乎不抑制沙门氏菌的生长。

3 结论与讨论

本研究分别选取了食品工业上常用的几种化学消毒剂：乙醇、“84”消毒液、洗洁精、H2O2、苯扎氯铵和苯扎溴铵，另外还有金属螯合剂EDTA和表面活性剂SDS；食品加工中常用的四种防腐剂苯甲酸钠、山梨酸钾、双乙酸钠及乳酸钠；最后又选择了几种天然成分物质：香芹酚、肉桂醛、百里香精油、茶多酚以及抗菌物质乳酸链球菌素。以S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34为研究对象，分别从对生物被膜形成过程的影响、对成熟生物被膜的清除效果、以及不同物质处理后生物被膜菌内细胞的代谢活性及活菌存活数这四个方面，评估了这些物质在鼠伤寒沙门氏菌生物被膜控制方面的作用效果。可以得出以下几个结论：

首先，化学消毒剂乙醇、H2O2、苯扎氯铵、苯扎溴铵在较低浓度下即可有效地抑制S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34生物被膜的形成，并且对成熟的生物被膜浸泡处理后，可以大大降低其内细胞的代谢活性及活菌数，不过在清除成熟生物被膜方面，较为理想的是过氧化氢，当其浓度达到6%时，对生物被膜的清除率可达到90%左右。

本研究中，苯甲酸钠、山梨酸钾和乳酸钠在高浓度下对两株S. typhimurium的生物被膜形成有较明显的抑制作用，但低浓度下效果不好，而双乙酸钠则几乎没什么作用。谢丽斯等[36]用山梨酸钾和苯甲酸钠对金黄色葡萄球菌生物被膜形成过程的影响进行研究，得出了在添加低质量浓度防腐剂山梨酸钾和苯甲酸钠后，金黄色葡萄球菌成膜能力也受到抑制的结论，这和本研究所得出的结论稍有不同。在对成熟生物被膜清除的实验中发现，防腐剂清除效果很弱，较高浓度下才发挥一定的清除作用。四种食品防腐剂处理S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34生物被膜后，对其内的细胞代谢活性进行检测发现随着防腐剂浓度的增加，被膜内细胞的活性降低，再通过平板稀释涂布法定量检测活菌数时，发现活菌数的下降程度也不明显，即防腐剂处理后，细胞活性的降低只是使沙门氏菌进入了休眠状态，并没有完全杀灭细菌，一旦条件合适，细菌即可继续生存。

在几种天然食品添加剂中，比较理想的是肉桂醛、香芹酚和百里香精油，这三种物质在低浓度下可基本抑制生物被膜的产生。这与戴雨芸等[18]所研究的香芹酚对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制，张文艳等[37]研究的肉桂醛对食源性致病菌金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌生物被膜的形成有抑制作用的结果是一致的，Niu等[38]也发现肉桂醛可以通过杀死细菌来有效抑制E.coli生物被膜的形成，在本研究中也发现，添加剂可以通过抑制菌体的生长而抑制生物被膜的产生。当这三种天然食品添加剂作用于成熟生物被膜后也可有效杀死生物被膜内的活菌数。

目前关于天然成分物质对生物被膜形成的抑制机理主要涉及抑制细菌菌体的生长、抑制群体感应系统，以及抑制生物被膜中胞外多糖和胞外蛋白的合成等方面。植物精油的成分复杂，一种精油通常由几十种到几百种化合物组成，主要为萜烯类化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物、含硫含氮化合物等小分子简单化合物[39]。已有很多研究证明天然植物精油中的主要成分是比较理想的群体感应抑制剂，群体感应抑制剂只是轻微抑制或不抑制细菌的生长，不会细菌的生长造成压力[27,40]。有研究表明芳樟醇不仅能抑制细菌的群体感应系统，还具有杀菌作用，芳樟醇可以破环铜绿假单胞菌的生物被膜，导致核酸外泄，杀灭细菌[41]。另有研究发现，低浓度的大蒜活性化合物在不影响铜绿假单胞菌生长的情况下，抑制该菌QS系统调控的毒力因子的产生，并且抑制生物被膜的形成以及群集运动[27,42]。此外，天然植物成分还可通过抑制或降解生物被膜基质的主要成分来抑制生物被膜的形成。如程锋等[43]发现茶树精油可通过抑制agrA、icaA、cidA及sarA等4种基因的表达，抑制金黄色葡萄球菌生物被膜形成过程中eDNA的释放以及PIA的合成，降低了生物被膜的粘附性，从而表现出抗生物被膜活性。而在本研究中发现香芹酚、肉桂醛和百里香精油可抑制细菌菌体的生长使菌体产生物被膜能力下降。如Khan等[44]也发现牛至中的香芹酚可通过降低变形链球菌的代谢活性，抑制生物被膜的形成。对于香芹酚、肉桂醛和百里香精油对本研究中鼠伤寒沙门氏菌生物被膜形成产生抑制的具体影响机制还需进一步的研究探索。

根据以上的结果可以总结出，不管是何种物质在清除成熟生物被膜时都没有达到100%的效果，这就可能会使得残留的生物被膜中微生物继续生长，导致加工环境或者产品受到再次污染。经不同材料处理后虽然有些物质表现出了较好的杀生物被膜菌的效果，但还是会有少部分细菌被生物被膜包裹起来而增强了对外界环境的耐受力，这也会是一个安全隐患[45]。控制生物被膜污染的最适宜的方法是在初始培养前，加入抑菌物质，抑制细菌菌体的生长，从而有效地控制生物被膜的形成。

本研究共选取了17种清除剂，分别是食品工业常用的8种消毒剂、常用的4种食品防腐剂以及5种天然食品添加剂，分别从四个方面系统比较了它们对生物被膜的控制及清除效果，发现过氧化氢不仅可以有效抑制S. typhimurium生物被膜的形成，对成熟生物被膜的清除也具有较好的效果，这对于食品工业中控制鼠伤寒沙门氏菌生物被膜的污染具有一定的参考意义。此外，在生物被膜形成的初始阶段控制生物被膜的污染是最为有效的。

目前，国内对于生物被膜的控制研究多是集中在革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌等和革兰氏阴性菌如副溶血性弧菌、铜绿假单胞菌等，针对沙门氏菌，尤其是S. typhimurium生物被膜的控制及清除研究报道的还较少。即使有报道，也只是单一的选取一种清除剂，并没有系统地比较多种清除剂或是不同控制方法的清除效果。本研究选取的清除剂涉及种类多、涵盖范围广，可以为寻找有效控制生物被膜污染提供一个思路。